自噬誘導(dǎo)劑海藻糖對(duì)帕金森癥小鼠的治療作用*

吳 鋒，秦巨峰

（1南通大學(xué)藥學(xué)院藥理系，江蘇226001；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院影像科）

·論著與基礎(chǔ)研究·

自噬誘導(dǎo)劑海藻糖對(duì)帕金森癥小鼠的治療作用*

吳 鋒1**，秦巨峰2

（1南通大學(xué)藥學(xué)院藥理系，江蘇226001；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院影像科）

目的：探討自噬誘導(dǎo)劑海藻糖對(duì)帕金森癥小鼠的治療作用。方法：使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶鹽酸鹽（MPTP）建立小鼠帕金森癥模型，通過觀察小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺（DA）神經(jīng)元數(shù)量、紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺及代謝產(chǎn)物變化，判斷海藻糖治療帕金森癥的作用。結(jié)果：（1）免疫組化染色發(fā)現(xiàn)MPTP使小鼠黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。海藻糖干預(yù)后可增加DA神經(jīng)元數(shù)量。（2）HPLC檢測發(fā)現(xiàn)MPTP造成小鼠紋狀體中多巴胺明顯減少，海藻糖組可增加神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物。結(jié)論：海藻糖能減少M(fèi)PTP造成的黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元丟失，增加紋狀體中多巴胺的含量，海藻糖能有效治療帕金森癥。

帕金森癥；自噬；海藻糖；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶鹽酸鹽；免疫組織化學(xué)法；小鼠

海藻糖（trehalose）是一種由兩個(gè)葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構(gòu)成的天然非還原性雙糖，通過蛋白質(zhì)-海藻糖相互作用影響蛋白質(zhì)折疊，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用[1]。海藻糖通過非依賴哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)自噬，清除神經(jīng)元內(nèi)突變型亨廷頓蛋白和α-突觸核蛋白對(duì)多種神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生治療作用[2-3]。帕金森癥（PD）是一種中老年常見的慢性進(jìn)展性神經(jīng)退行性疾病，它以中腦黑質(zhì)多巴胺（DA）神經(jīng)元缺損為主要病理基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以MPTP制備帕金森癥小鼠模型，觀察海藻糖能否起到治療作用，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶鹽酸鹽（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride，MPTP，sigma，3.5mg·mL-1），溶于0.9%生理鹽水溶液；海藻糖（sigma，0.2mg·mL-1），溶于0.9%生理鹽水溶液；清潔級(jí)雄性C57bl/6小鼠，質(zhì)量25～30 g，雄性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2003—0003。

1.2 方法 （1）分組：C57bl/6小鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為生理鹽水正常對(duì)照組、MPTP模型組、海藻糖正常對(duì)照組和海藻糖治療組。MPTP 20mg·kg-1腹腔注射，每隔2h連續(xù)注射4次，造模7d后取材。海藻糖2g·kg-1于MPTP最后1次注射后腹腔注射，每隔2d注射1次，同時(shí)予2%溶于雙蒸水普通喂養(yǎng)[4]，將動(dòng)物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進(jìn)食。（2）免疫組化檢測：7天后小鼠以4%戊巴比妥鈉麻醉，順序灌注PBS（pH值7.4)和

4%多聚甲醛(pH值7.4)，灌流后鼠腦在4%多聚甲醛中后固定6h,冰凍切片機(jī)制備中腦區(qū)腦片(40μm)。予0.5%Triton x-100透膜，5%山羊血清封閉，酪氨酸羥化酶抗體（1∶2 000）一抗孵育過夜，生物素二抗（1∶500），ABC法用于檢測抗原（1∶100），DAB染色拍片。（3）HPLC檢測：小鼠斷頭后迅速取出全腦，在4℃冰浴中迅速分離出紋狀體，稱重后立即投入液氮中。每10mg組織加0.2mL內(nèi)標(biāo)溶液（高氯酸0.1mol/L，3,4二羥基芐胺0.1μg/mL，焦亞硫酸鈉0.04%，EDTA0.04%），在冰浴下用玻璃勻漿器勻化1min。然后4℃14 000×離心20min，取出上清液，置于-80℃凍存，每次取20μL注入HPLC進(jìn)行分析檢測。

**[作者簡介]吳鋒，男，漢族，江蘇南通人，生于1980年10月，碩士，講師。研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0軟件分析處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

酪氨酸羥化酶免疫組化染色發(fā)現(xiàn)MPTP制備帕金森癥小鼠急性模型造成C57bl/6小鼠黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。海藻糖干預(yù)后可以減輕MPTP的急性損傷作用，增加DA神經(jīng)元數(shù)量，見圖1（P<0.05）。HPLC檢測發(fā)現(xiàn)MPTP造成C57bl/6小鼠紋狀體中，DA神經(jīng)元突觸投射區(qū)內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物3,4-二羥苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)均明顯減少。海藻糖組可以增加上述神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物，見圖2～4（P<0.05）。

圖1 海藻糖對(duì)MPTP帕金森癥模型小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺神經(jīng)元存活數(shù)量的影響

圖2 海藻糖對(duì)帕金森癥小鼠紋狀體中多巴胺的影響

圖3 海藻糖對(duì)帕金森癥小鼠紋狀體中DOPAC的影響

圖4 海藻糖對(duì)帕金森癥小鼠紋狀體中HVA的影響

3 討 論

目前研究認(rèn)為帕金森癥病因可能是環(huán)境因素和遺傳因素的共同作用結(jié)果，近年來發(fā)現(xiàn)線粒體功能缺陷在帕金森癥中起重要作用[5]。MPTP模型是通過損傷中腦DA神經(jīng)元線粒體功能，引發(fā)帕金森癥的最常用的動(dòng)物模型。該模型具備成模穩(wěn)定，制備簡單等優(yōu)點(diǎn)，而且MPTP是目前唯一已知的可以在人類及靈長目動(dòng)物造成帕金森癥的神經(jīng)毒素[6]。破損的線粒體可增加活性氧（ROS）的釋放損傷神經(jīng)元，所以加速清除已經(jīng)喪失功能的破損線粒體已經(jīng)成為帕金森癥治療的新的靶點(diǎn)[7]。自噬是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，在一些生理和應(yīng)激、毒素、饑餓等病理因素的誘導(dǎo)下，由一種前自噬結(jié)構(gòu)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，延伸包裹待降解的蛋白質(zhì)、破損細(xì)胞器，形成自噬體。然后自噬體的外膜和溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體。內(nèi)膜和包裹的物質(zhì)進(jìn)入溶酶體腔，被蛋白水解酶降解，降解后的成分可被細(xì)胞循環(huán)利用，從而維持了細(xì)胞的自身穩(wěn)定[8]。海藻糖是一種典型的非依賴mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的自噬誘導(dǎo)劑，本身作為食品不具備毒性，同時(shí)能夠加速自噬流幫助清除帕金森癥致病因素中的累積的破損線粒體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在帕金森癥病理過程中，海藻糖能夠有效遏制黑質(zhì)區(qū)DA神經(jīng)元丟失，起到治療帕金森癥的目的，但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]Chen Q,Haddad GG.Role of trehalose phosphate synthase and trehalose during hypoxia:from flies to mammals［J］.J Exp Biol,2004,207(Pt 18):3125-3129.

[2]Tanaka M,Machida Y,Niu S,et al.Trehalose alleviates polyglutamine-mediated pathology in a mouse model of Huntington disease［J］.Nat Med,2004,10(2):148-154.

[3]Lan DM,Liu FT,Zhao J,et al.Effect of trehalose on PC12 cells overexpressing wild-type or A53T mutant α-synuclein［J］.Neurochem Res,2012,37(9):2025-2032.

[4]Castillo K,Nassif M,Valenzuela V,et al.Trehalose delays the progression of amyotrophic lateral sclerosis by enhancing autophagy in motoneurons［J］.Autophagy,2013,9(9):1308-1320.

[5]Osellame LD,Duchen MR.Defective quality control mechanisms and accumulation of damaged mitochondria Link Gaucher and Parkinson diseases［J］.Autophagy,2013,9(10): 1633-1635.

[6]Jackson-Lewis V,Przedborski S.Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease［J］.Nat Protoc,2007,2 (1):141-151.

[7]Chu CT,Bayir H,Kagan VE.LC3 binds externalized cardiolipin on injured mitochondria to signal mitophagy in neurons:implications for Parkinson disease［J］.Autophagy,2014, 10(2):376-378.

[8]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research［J］.Cell,2010,140(3):313-326.

The Effect of Trehalose,an Autophagy Enhancer, in the MPTP Model of Parkinson’s Disease

WU Feng1,QIN Jufeng2
(1Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Nantong University,Jiangsu 226001；1Department of Radiology，Affiliated Hospital of Nantong University)

Objective:To explore the effect of trehalose in the MPTP model of Parkinson’s disease.Methods:The number of surviving dopaminergic(DA)neurons in substantia nigra pars compacta (SNpc)and levels of dopamine and its main metabolites,3,4-dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)and homovanillic acid(HVA)in striatum were evaluated.Results:Trehalose rescued midbrain DA neurons from MPTP toxicity and increased the levels of dopamine,DOPAC,and HVA in striatum.Conclusion:Trehalose could be used for treatment of Parkinson’s disease.

Autophagy;Trehalose;Parkinson’s disease;MPTP

R742.5

A

國家青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31300893）；南通市科技項(xiàng)目（BK2012094）。

2014-07-03

1006-2440（2014）04-0316-03