馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物對(duì)SD大鼠生化指標(biāo)的影響研究

韓絲銀，郭 健，紀(jì)麗麗，蔡麗雙，谷長(zhǎng)生，宋文東，*

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；3.浙江海洋學(xué)院石化與能源工程學(xué)院，浙江舟山316022；4.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東湛江524088）

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）又稱合浦珍珠貝，是我國(guó)南海養(yǎng)殖珍珠的主要貝類之一，馬氏珠母貝肉是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，其粗蛋白的含量約為貝肉干重的75%[1]，此外，它還含有生理活性的游離氨基酸，其中?；撬岷孔罡哌_(dá)1.38%，占總量的74%，無機(jī)鹽含量也十分豐富，尤其是微量元素Zn和Se[2]。大量研究表明，馬氏珠母貝肉不但有抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等生理作用，還具有安神定驚、平肝潛陽(yáng)、清熱解毒的功效[3-9]，因此，馬氏珠母貝肉具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，其開發(fā)利用前景廣闊。

隨著珍珠養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，廣東、廣西、海南等主要養(yǎng)殖區(qū)采珠后馬氏珠母貝肉有4000多t，數(shù)量相當(dāng)可觀。但目前主要被用于飼料加工及曬成干品出售，利用程度低下，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)附加值不高[10]，很少有對(duì)其進(jìn)行深入處理后藥用和保健價(jià)值的相關(guān)報(bào)道，因此充分開發(fā)利用馬氏珠母貝肉功能價(jià)值的研究是非常必要的，本實(shí)驗(yàn)考察了馬氏珠母貝肉的酶解優(yōu)化條件，并測(cè)定了其酶解產(chǎn)物對(duì)SD大鼠血清生化指標(biāo)的影響，探討了其對(duì)肝功能和心血管保護(hù)的功效，旨在為資源豐富的馬氏珠母貝肉的綜合利用及開發(fā)相關(guān)功能性保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬氏珠母貝 采自廣東省湛江市徐聞縣珍珠養(yǎng)殖基地，開殼取貝肉（全臟器），清洗后-18℃冷凍備用；清潔級(jí)SD雄性大鼠 共16只，平均體重為（80±5）g，動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK（粵）2011-015，購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；實(shí)驗(yàn)日糧 SD大鼠飼喂基礎(chǔ)日糧（組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1）；木瓜蛋白酶（酶活為300萬(wàn)U/g） 北京酶制劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

電子天平 余姚銘記稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠制造；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；精密pH計(jì) 上?？祪x儀器有限公司；電熱恒溫水熱鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；EX3600全自動(dòng)生化分析儀 廣州市朗道科技開發(fā)有限公司。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）Table1 Composition and nutrient levels of diets（air-dry basis，%）

1.2 工藝流程

馬氏珠母貝肉→解凍→清洗→瀝干→攪碎→保溫酶解→滅酶→離心→上清液→水解度測(cè)定。

取瀝干的馬氏珠母貝肉用搗碎機(jī)打漿，用蒸餾水制成5%的勻漿，然后加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在特定溫度下酶解一定時(shí)間。滅酶，離心，取上清液測(cè)定水解度。

1.3 馬氏珠母貝肉酶解的條件優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1.1 木瓜蛋白酶用量實(shí)驗(yàn) 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，木瓜蛋白酶在pH 7.0，溫度為60℃條件下水浴30m in，考察酶用量（木瓜蛋白酶用量與馬氏珠母貝肉原料質(zhì)量比）分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%對(duì)水解度的影響。

1.3.1.2 酶解溫度實(shí)驗(yàn) 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，在pH 7.0，酶用量0.6%條件下，溫度分別為55、 60、65、70、75、80℃水浴30m in，對(duì)馬氏珠母貝肉進(jìn)行酶解。

1.3.1.3 酶解時(shí)間實(shí)驗(yàn) 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，在pH 7.0，酶用量為0.6%，溫度70℃條件下，分別水浴10、15、20、25、30、35m in，對(duì)馬氏珠母貝肉進(jìn)行酶解。

1.3.1.4 酶解pH實(shí)驗(yàn) 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，在酶用量0.6%，溫度70℃條件下，pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0水浴30m in，對(duì)馬氏珠母貝肉進(jìn)行酶解。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度為考察指標(biāo)，首先通過單因素實(shí)驗(yàn)考察木瓜蛋白酶用量、溫度、pH和時(shí)間對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響，初步確定馬氏珠母貝肉酶解條件的范圍，然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表對(duì)酶解條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，其因素水平安排見表2。

表2 馬氏珠母貝肉酶解正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table2 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 總氮含量的測(cè)定 馬氏珠母貝中總氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定[11]。

1.4.2 游離氨基氮的測(cè)定 游離氨基氮含量采用茚三酮法測(cè)定[12]。

1.4.3 水解度的計(jì)算 計(jì)算公式如下：

馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度DH（%）=水解液中游離基氮含量（mg/m L）/樣品中的總氮含量（mg/m L）×100。

1.5 注射液配制

在配制容器中，依次加入注射用水800m L，生理鹽水80m L，馬氏珠母貝肉酶解上清液100m L，混勻，用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0左右，再加入注射用水定量至1000m L，混勻，過濾兩次（先砂濾棒過濾一次，再用孔徑為0.65μm微孔濾膜過濾一次），分裝于中性玻璃容器中，高壓滅菌30m in，在0～4℃溫度條件保存。

1.6 注射管理

SD大鼠在相同條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組8只，對(duì)照組8只，自由采食、飲水。一周后，在喂食2h后，實(shí)驗(yàn)組的SD大鼠腹腔（0.1m L/10g）注射所配制的注射液，對(duì)照組腹腔注入等量生理鹽水。連續(xù)注射2d，1d兩次。

1.7 樣品采集與測(cè)定

注射實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24h，然后將所有大鼠麻醉后切開腹部，于腹股動(dòng)脈抽取血液，3500r/m in離心10min，分離血清，保存于-20℃，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定其生化指標(biāo)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)處理，Origin 9.0繪圖分析，并采用SPSS 17.0進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬氏珠母貝肉酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 木瓜蛋白酶用量對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖1可以看出，隨著酶用量增加，酶解液的水解度呈增加趨勢(shì)，且在酶用量為0.6%的時(shí)候水解度已經(jīng)接近最大值，若此時(shí)增加酶用量，水解度的值也不會(huì)顯著增加。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，酶的濃度超過一定范圍，它的催化速率也不會(huì)再上升，而是維持在一個(gè)平衡的狀態(tài)。故選擇酶用量為0.6%時(shí)最佳。

圖1 酶用量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of dosage of enzyme on degree of hydrolysic

2.1.2 溫度對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖2可以看出，反應(yīng)溫度低于70℃時(shí)，隨著溫度的升高，水解度逐漸上升，當(dāng)溫度大于70℃時(shí)，隨著溫度的持續(xù)升高，水解度迅速下降。由酶促反應(yīng)原理可知，當(dāng)酶在一定溫度范圍，隨著反應(yīng)溫度升高而加快反應(yīng)速度，但溫度超過某一界限后，蛋白質(zhì)會(huì)變性，變性的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于反應(yīng)的速度。因此，酶解溫度在70℃時(shí)，馬氏珠母貝肉酶解效果最好。

圖2 溫度對(duì)水解度的影響Fig.2 Effectof temperature on degree of hydrolysic

2.1.3 時(shí)間對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度先迅速增大，后趨于穩(wěn)定，當(dāng)水解超過30min，馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度變化不大，原因可能是在30m in時(shí)木瓜蛋白酶對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)的水解已經(jīng)達(dá)到了平衡狀態(tài)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也不會(huì)發(fā)生變化，故水解時(shí)間為30～35m in區(qū)間內(nèi)時(shí)，馬氏珠母貝肉酶解效果最好。

圖3 時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of time on degree of hydrolysic

2.1.4 pH對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖4可以看出，當(dāng)pH＜8.0的時(shí)候，隨著pH的增大，水解度都呈顯著增大趨勢(shì)，在pH 8.0時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)pH＞8.0時(shí)，隨著pH升高，水解度逐漸下降；這是因?yàn)榇蟛糠置傅幕盍κ芷洵h(huán)境pH的影響，由于環(huán)境體系中酸、堿度的改變，酶的空間結(jié)構(gòu)受到影響，極端情況可以致使酶失活；即酶在一定pH條件下，酶反應(yīng)具有最大速度，此時(shí)酶活力相對(duì)最高，高于或者低于此值，反應(yīng)速度下降。因此選擇pH8.0作為木瓜蛋白酶酶解馬氏珠母貝肉的最適pH。

圖4 pH對(duì)水解度的影響Fig.4 Effectof pH on degree of hydrolysic

2.2 酶解馬氏珠母貝肉的正交實(shí)驗(yàn)

從表3、表4分析可知，對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度值影響的大小次序?yàn)锽（溫度）＞D（pH）＞A（酶用量）＞C（時(shí)間），即溫度對(duì)馬氏珠母貝肉酶解效果影響最大，pH對(duì)酶解效果影響次之，酶用量對(duì)酶解效果影響較小，時(shí)間對(duì)酶解效果影響最小。通過各因素綜合分析，馬氏珠母貝肉酶解最優(yōu)條件為A2B2C3D2，即酶用量0.6%，溫度70℃，時(shí)間35m in，pH 8.0，在此條件下，馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度為54.79%。

2.3 馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物對(duì)SD大鼠的血清指標(biāo)的影響

由表5可以看出，馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物處理組使SD大鼠血清中前白蛋白、載脂蛋白A1分別上升了38.07%（p＜0.05）、276%（p＜0.05），谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、載脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、超敏C反應(yīng)蛋白、葡萄糖、間接膽紅素分別下降了44.57%（p＜0.05）、40.4%（p＜0.05）、46.67%（p＜0.05）、42.13%（p＜0.05）、100%（p＜0.05）、36.97%（p＜0.05）、49.49%（p＜0.05）。

表3 馬氏珠母貝肉酶解正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Orthogonal array design scheme and corresponding results

表4 方差分析表Table4 Analysis of variance

表5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組SD大鼠血清生化指標(biāo)的比較Table5 The comparison between experimental group and control group of serum biochemical indicators in animal SD rat

給SD大鼠注射馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物，使其血清中的前白蛋白較對(duì)照組顯著升高（p＜0.05），谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、超敏C反應(yīng)蛋白、間接膽紅素較對(duì)照組顯著下降（p＜0.05），而在肝病診斷中，血清前白蛋白（PA）是一項(xiàng)反映肝功能受損情況的早期敏感的指標(biāo)[13]，肝功能損害程度越嚴(yán)重，血清PA越低[14]。超敏C-反應(yīng)蛋白（CRP）是一種正時(shí)相反應(yīng)蛋白，它和PA是相對(duì)應(yīng)的[15]，在肝組織受到損傷時(shí)，因存在一定的炎癥應(yīng)急激反應(yīng)，CRP就會(huì)增高[16]。轉(zhuǎn)氨酶升高也是反映肝臟損傷的標(biāo)志之一，在臨床上較常見，而在谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷酰轉(zhuǎn)肽酶等肝酶中，ALT與肝臟脂肪聚集關(guān)系最為密切[17]。膽紅素代謝主要在肝臟進(jìn)行，新生兒時(shí)期膽紅素產(chǎn)生過多，會(huì)使肝細(xì)胞負(fù)荷加重、膽紅素對(duì)肝細(xì)胞的直接毒性作用、炎癥反應(yīng)破壞肝細(xì)胞[18]而使肝酶異常。因此本研究結(jié)果表明馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物能夠促進(jìn)肝功能逐漸恢復(fù)正常。

給SD大鼠注射馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物，使其血清中的載脂蛋白A1較對(duì)照組顯著升高（p＜0.05），超敏C-反應(yīng)蛋白、載脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、葡萄糖較對(duì)照組顯著下降（p＜0.05），而Ridker等[19]研究認(rèn)為，高水平的CRP使急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)增加3倍，是較敏感的心血管預(yù)測(cè)因子。國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)臨床資料顯示，心肌梗死和腦卒中患者與對(duì)照組比較載脂蛋白A1明顯降低，載脂蛋白B顯著增高。總結(jié)國(guó)外人群前瞻性研究結(jié)果顯示，載脂蛋白A1、B在預(yù)測(cè)ACVD和冠狀動(dòng)脈事件的危險(xiǎn)性優(yōu)于LDLC、TC、TG和HDLC等[20-25]。肌酸激酶同工酶（CK-MB）在心血管疾病中，是診斷心肌梗死的敏感指標(biāo)[26-27]。急性心肌梗死（AMI）時(shí)心肌細(xì)胞受損，膜的完整性和通透性改變，使細(xì)胞內(nèi)的大分子逸出，其中CK-MB是逸出最早，上升幅度最大的一種酶[28]，并且肝炎合并心肌損害時(shí)也易引起CK-MB相對(duì)值升高，嚴(yán)重肝損害或高黃疽時(shí)都可能出現(xiàn)CK-MB絕對(duì)值升高。而糖尿病是世界公認(rèn)的冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[29]，AM I后血糖升高會(huì)導(dǎo)致患者的心機(jī)損害加重，病死率明顯高于血糖正常組[30]。所以積極有效地控制AM I患者的血糖水平，預(yù)防糖尿病的發(fā)生，對(duì)早期預(yù)防和控制并發(fā)癥，降低患者的病死率有積極作用。因此本研究結(jié)果表明馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物能夠減少心肌損害，縮小梗死面積，降低心律失常、心力衰竭、心源性休克及死亡病例的發(fā)生。

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化馬氏珠母貝肉酶解的工藝條件，結(jié)果表明，各因素對(duì)馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度影響大小次序是溫度＞pH＞酶用量＞時(shí)間，同時(shí)確定了馬氏珠母貝肉酶解的最適工藝條件，即酶用量0.6%，溫度70℃，時(shí)間35m in，pH8.0。對(duì)SD大鼠注射馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物的調(diào)配試劑，使血清中前白蛋白、載脂蛋白A1顯著上升（p＜0.05），谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、載脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、超敏C反應(yīng)蛋白、葡萄糖、間接膽紅素較對(duì)照組顯著下降顯著下降（p＜0.05），結(jié)合相關(guān)研究，推測(cè)出馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物有保肝、保心血管的功效。因此馬氏珠母貝肉酶解液是值得開發(fā)的功能性物質(zhì)。

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