樺褐孔菌次生代謝產(chǎn)物清除自由基活性成分的分離純化及初步鑒定

李婉珍，潘 燕，葛 飛，樊美珍

（1.安徽工程大學(xué)，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000；2.安徽省微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）為多孔菌科（Polyporaceae）纖孔菌屬（Inonotus）的藥用真菌[1]。在我國(guó)主要生長(zhǎng)在吉林、黑龍江、西藏、青海等高海拔山區(qū)的樺屬樹(shù)木上[2]。

樺褐孔菌是一種具有很高藥用價(jià)值、應(yīng)用前景廣泛的真菌。近期研究結(jié)果表明，樺褐孔菌除了具有抗腫瘤[3-4]、抗病毒、降血壓、改善血液循環(huán)、調(diào)整血壓、降低血膽固醇、增強(qiáng)免疫的作用外，還具有清除體內(nèi)自由基和明顯的抗氧化作用[5-8]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)樺褐孔菌多糖及抗氧化活性的相關(guān)研究較多[9-12]，而對(duì)樺褐孔菌菌株發(fā)酵液清除自由基活性成分分離純化研究的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少[13-15]，尤其是對(duì)活性組分純化合物的結(jié)構(gòu)鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以清除自由基活性為目標(biāo)，對(duì)樺褐孔菌次生代謝產(chǎn)物中清除自由基活性成分進(jìn)行研究，并采用多種分離方法對(duì)其活性組分進(jìn)行分離純化，旨在分離出具有清除自由基活性的純化合物，為樺褐孔菌深層發(fā)酵產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat） 由吉林應(yīng)用真菌研究所提供；二苯代苦味肼基自由基（DPPH） 購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；其他試劑 為國(guó)產(chǎn)分析純。

B685型中壓液相色譜儀 瑞士BUCHI；Spectra M 2酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；FREEZONE 12型凍干機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司；柱層析系統(tǒng) 上海滬西分析儀器廠；6010型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海惠普分析儀器有限公司；Waters Spherisorb ODS2型高效液相色譜（HPLC）分析柱（4.6mm×250mm，5μm）、Waters 2487型雙波長(zhǎng)檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；Summetryshield RP18柱（5μm，3.9×150mm） Korean，Autocharm工作站。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌發(fā)酵液乙酸乙酯脂溶相樣品的制備

本實(shí)驗(yàn)將樺褐孔菌菌株發(fā)酵液濃縮至1/20倍加入3倍體積95%乙醇（乙醇終濃度為75%）醇沉，室溫下靜置24h，5000r/min離心10min，取上清液濃縮脫醇，加入3倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，待分層后得酯溶相，將酯溶相濃縮至干備用。

1.2.2 乙酸乙酯提取脂溶相清除自由基活性的定性分析 本實(shí)驗(yàn)將發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物配制成1.0mg/m L的甲醇溶液，采用二苯基苦基苯肼自由基薄層實(shí)驗(yàn)法（DPPH-TLC-ASSAY）[16]進(jìn)行自由基活性的定性分析。

1.2.3 清除自由基活性的測(cè)定方法 采用DPPH-酶標(biāo)儀法[17]：加用95%甲醇配制的不同濃度的樣品100μL和用95%甲醇配制好的DPPH試液100μL置于96孔酶標(biāo)板中，37℃條件下振蕩30s，選擇波長(zhǎng)在517nm處測(cè)其吸光值。每樣品平行測(cè)定3次。然后按下述公式計(jì)算自由基清除率：

式中，Ap—樣品加入DPPH試液的吸光值（517nm處吸光值）；Ac—樣品不加入DPPH試液的吸光值；Amax—DPPH試液不加樣品（以95%甲醇代替）的吸光值。

1.2.4 乙酸乙酯提取脂溶相經(jīng)反相柱（Summetryshield RP18）粗分 本實(shí)驗(yàn)中中壓液相色譜采用硅膠含量為80g鍵合的C18的柱材料，色譜柱直徑為5cm，長(zhǎng)度為30cm。

將待分樣品甲醇充分溶解，加到中壓液相色譜（MPLC）的加樣管中，依次采用100%雙蒸水（Ⅰ）、30%甲醇水溶液（Ⅱ）、50%甲醇水溶液（Ⅲ）、70%甲醇水溶液（Ⅳ）、100%甲醇溶液（Ⅴ）五種梯度進(jìn)行洗脫。按不同梯度分別收集樣品濃縮至干，各組分樣品和DPPH分別用95%甲醇配制成濃度為1mg/m L溶液，進(jìn)行清除自由基活性檢測(cè)。

1.2.5 凝膠柱層析（SephadexLH-20）法對(duì)粗分的樣品分離 制備凝膠層析柱及上樣分離[18]，調(diào)整柱流速在1滴/20s左右進(jìn)行洗脫，加足流動(dòng)相甲醇，用自動(dòng)收集儀分管進(jìn)行收集，每管控制收集5m L左右。應(yīng)用TLC法對(duì)收集的樣品進(jìn)行合并濃縮，分別配制濃度為0.5mg/m L甲醇溶液，DPPH用甲醇配成濃度為0.8mg/m L的試劑，進(jìn)行清除自由基活性檢測(cè)。

1.2.6 硅膠柱層析法對(duì)分離樣品純化 采用干法裝柱及上樣[19]，依次采用100%石油醚、石油醚∶氯仿（10∶1）、100%氯仿、氯仿∶甲醇（100∶1）、100%甲醇洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，以20滴/m in的流速開(kāi)始洗脫，每20m L收集一管。收集到的各個(gè)組分采用TLC法分析，把相同Rf值的組分進(jìn)行合并。

1.2.7 重結(jié)晶 用氯仿∶石油醚（1∶10）混合溶劑20m L溶解0.5g樣品，裝入潔凈的小玻璃管中，用封口膜封口后用小針在膜上刺幾個(gè)小孔，將小管置于干燥器或4℃冰箱中，使有機(jī)溶劑緩慢揮發(fā)7～30h。同時(shí)，在觀察時(shí)，避免晃動(dòng)液體。

1.2.8 純度鑒定

1.2.8.1 薄層層析法（TLC） 本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品LWZc采用氯仿∶甲醇（C∶M）=10∶1、氯仿∶丙酮（C∶AC）=3∶2、石油醚∶乙酸乙酯（PE∶EA）=5∶1三種不同極性的展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi)，樣品LWZf采用氯仿∶丙酮=3∶2展開(kāi)劑展開(kāi)，脫尾現(xiàn)象嚴(yán)重，再采用A#（氯仿∶丙酮∶甲酸=240∶160∶1）、B#（氯仿∶丙酮∶甲酸∶水=120∶80∶1∶5）兩種展開(kāi)劑展開(kāi)，待溶劑揮發(fā)后在254nm紫外燈下觀察熒光猝滅斑點(diǎn)，再在碘蒸汽條件下和10%H2SO4顯色劑條件下顯色觀察。

1.2.8.2 高效液相色譜法（HPLC） 樣品溶解于適量的甲醇（色譜級(jí)）中，然后進(jìn)行HPLC純度檢驗(yàn)。色譜條件：色譜柱：waters 4.6mm×250mm，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：190～400nm全波長(zhǎng)下掃描，流動(dòng)相：0.005%甲酸水與甲醇（色譜級(jí)）梯度洗脫，流速：控制在0.5m L/min～1.0m L/m in。

1.2.9 結(jié)構(gòu)解析

1.2.9.1 活性組分的HPLC-TOF-MS分析 將檢測(cè)到的活性組分通過(guò)HPLC-TOF-MS進(jìn)一步確認(rèn)分析。質(zhì)譜檢測(cè)條件為：電噴霧離子源（ESI）的霧化氣壓為35psi；氮?dú)饬魉贋?2.0L/m in，溫度為325℃；陽(yáng)離子模式離子化電壓為4000V，碎片電壓215V；陰離子模式離子化電壓為3500V，碎片電壓175V。

色譜條件：色譜柱：waters 4.6mm×250mm，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：190～400nm全波長(zhǎng)下掃描，流動(dòng)相：0.005%甲酸水與甲醇（色譜級(jí)）梯度洗脫，流速：控制在0.5～1.0m L/m in。

1.2.9.2 核磁共振（1H-NMR） 采用500M核磁共振測(cè)量化合物的1H-NMR圖譜，待溶解化合物L(fēng)wzf和Lwzc的溶液自然揮發(fā)至干后，分別取樣品干粉2mg溶于氘代甲醇和氘代氯仿中，轉(zhuǎn)移至潔凈的核磁管中，在常溫下測(cè)試核磁共振1H-NMR氫譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸乙酯提取脂溶相清除自由基活性的定性分析

乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基活性定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 清除DPPH自由基活性的定性分析Fig.1 DPPH-TCL assay of Inonotus obliquus extracts

樣品帶有多條黃色（黑白圖片中為白色）色帶呈現(xiàn)，說(shuō)明樺褐孔菌菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物中含有清除DPPH自由基的活性成分。該樣品中活性成分有一種極性較低（Rf值＞0.7）化合物，多種成分為極性較強(qiáng)（Rf值＜0.5）化合物。

2.2 乙酸乙酯提取脂溶相經(jīng)反相柱（Summetryshield RP18）的粗分離

圖2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五個(gè)組分的DPPH自由基清除率Fig.2 Free radical scavenging rate ofⅠ、Ⅱ、Ⅲ、ⅣandⅤ

由圖2可以看出，5.8g樣品經(jīng)反相柱的粗分離，得到Ⅰ（2.2484g）、Ⅱ（1.81534g）、Ⅲ（340.26mg）、Ⅳ（178.16mg）、Ⅴ（169.52mg）5個(gè)組分。其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個(gè)組分都有較強(qiáng)的清除DPPH自由基作用，而Ⅳ、Ⅴ兩個(gè)組分幾乎沒(méi)有清除DPPH自由基的作用，Ⅰ組分極性太大通常很難分離，因此，選?、蚝廷髢蓚€(gè)組分作為進(jìn)一步分離的兩個(gè)組分。

2.3 凝膠柱層析（SephadexLH-20）法對(duì)粗分樣品的分離

將粗分樣品Ⅱ和粗分樣品Ⅲ分別通過(guò)1.2.5實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步分離，粗分樣品Ⅱ分離得出A、B、C、E、F五個(gè)組分，粗分樣品Ⅲ分離得出D組分，各組分清除DPPH自由基的活性分析見(jiàn)圖3。C、F組分具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，其他組分清除自由基的能力較弱，選擇C和F兩組分進(jìn)行硅膠柱分離和純化。

2.4 硅膠層析和重結(jié)晶對(duì)樣品的純化

對(duì)C組分樣品采用1.2.6方法進(jìn)行純化，得到化合物L(fēng)WZc，對(duì)F組分樣品依次采用1.2.6和1.2.7方法進(jìn)行梯度洗脫和重結(jié)晶，得到化合物L(fēng)WZf。對(duì)化合物L(fēng)WZc和LWZf配制濃度為0.2mg/m L甲醇溶液，DPPH用甲醇配成濃度為0.4mg/m L的試劑，進(jìn)行清除DPPH自由基活性的分析，對(duì)DPPH自由基的清除率分別為51.2%和71.5%。

圖3 A、B、C、D、E、F六個(gè)組分的DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate of A，B，C，D，E and F

2.5 純度鑒定

采用薄層層析法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）對(duì)LWZc和LWZf進(jìn)行純度鑒定。

2.5.1 薄層層析法（TLC） LWZc和LWZf的TLC圖見(jiàn)圖4和圖5。由圖4、圖5可以看出，樣品LWZC、LWZf在薄層板上都只有一個(gè)斑點(diǎn)，可以初步認(rèn)定兩種化合物均為單一化合物。

圖4 LWZC在三種不同展開(kāi)劑中的TLC圖譜Fig.4 Chromatogram of the Lwzc in differentmobile phase

圖5 LWZf在兩種不同展開(kāi)劑中的展開(kāi)效果Fig.5 Chromatogram of the Lwzf in differentmobile phase

2.5.2 高效液相色譜法（HPLC） 通過(guò)190～400nm全波長(zhǎng)掃描，LWZc和LWZf在254nm條件下吸收峰值高且溶劑峰干擾小，其他波段也有該物質(zhì)的吸收峰（出峰時(shí)間相同），但是峰值不明顯或溶劑峰干擾大。圖6、圖7分別為樣品LWZc和LWZf在254nm條件下的吸收峰，該樣品為單一組分。

圖6 樣品LWZf的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of the purified components LWZf

2.6 純組分的結(jié)構(gòu)解析

本文采用液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合1H核磁共振譜對(duì)化合物L(fēng)WZf和LWZc的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

2.6.1 LWZf的結(jié)構(gòu)解析

2.6.1.1 化合物L(fēng)WZf的HPLC-TOF-MS圖譜分析 從HPLC-MS的HPLC圖6中可以看到一個(gè)主峰，其保留時(shí)間為3.25m in。從MS陰離子圖譜（圖8）可看出該化合物[M-H]-離子峰為137.0254，所以該化合物的分子量應(yīng)為138.0254，而且從陰離子模式的MS圖譜上可以看出該物質(zhì)有一個(gè)[M-COOH]-碎片峰為93.0362，說(shuō)明該化合物含有一個(gè)羧基。

圖8 LWZf的陰離子液質(zhì)聯(lián)用譜圖Fig.8 The HPLC-TOF-MSatlas of LWZf in negative ion condition

2.6.1.2 化合物L(fēng)WZf的1H核磁共振圖譜分析 由化合物L(fēng)WZf的1H-NMR圖譜（圖9）可知，化合物僅在位移值為6.8和7.8處有兩個(gè)相互偶合的峰，偶合常數(shù)8.2左右，可能是苯環(huán)上兩個(gè)偶位偶合的氫，也可能是苯環(huán)對(duì)位取代后兩組相互偶合的氫。結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用圖譜分析結(jié)果可推測(cè)出該化合物為對(duì)羥基苯甲酸，分子式為：C7H6O3。結(jié)構(gòu)式為：

圖9 樣品LWZc的1H-NMRFig.9 The 1H-NMR atlas of the purified compound Lwzc

已知化合物對(duì)羥基苯甲酸為代表性酚酸類物質(zhì)，能抗氧化、清除氧自由基。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)化合物L(fēng)WZf的檢測(cè)結(jié)果與化合物對(duì)羥基苯甲酸的理化性質(zhì)相一致，且從樺褐孔菌中分離得到該化合物是首次報(bào)道。

2.6.2 LWZc的結(jié)構(gòu)解析

2.6.2.1 化合物L(fēng)WZc的HPLC-TOF-MS圖譜分析 從MS陽(yáng)離子質(zhì)譜圖（圖10）可看出該化合物[M+H]-離子峰為284.5，所以該化合物的分子量應(yīng)為283.5，根據(jù)氮規(guī)則可知，該化合物至少含有一個(gè)氮，且從該化合物分解之后的質(zhì)譜圖可以看出，該化合物分解之后的陽(yáng)離子離子峰為136.0313，所以該化合物被分解之后的分子量應(yīng)為135.0313，且從圖11都可以看出該化合物有一個(gè)丟失了[M-COOH]-的碎片峰108.0530，說(shuō)明該化合物含有一個(gè)羰基。

圖10 LWZc的陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig.1 0 The HPLC-TOF-MSatlas of LWZc in postive ion condition

圖11 LWZc分解后陽(yáng)離子質(zhì)譜圖Fig.1 1 The HPLC-TOF-MSof LWZc decomposition in negative ion condition

2.6.2.2 化合物L(fēng)WZc的1H核磁共振圖譜分析 由化合物L(fēng)WZc的1H-NMR圖譜（圖12）可知，該化合物有一個(gè)位移值為6.21的芳?xì)淇赡苁青徫簧嫌幸粋€(gè)氨基，從位移值4.48推斷該化合物可能為一糖甙類化合物，且從位移值6.21、6.908、7.325推斷甙元部分可能為一個(gè)三取代苯環(huán)氫，取代的位置分別為鄰位和間位。

圖1 2樣品LWZc的1H-NMRFig.1 2 The 1H-NMR atlas of the purified compound Lwzc

綜合以上分析，可初步推斷該化合物的分子式為C13H17NO6，可能的結(jié)構(gòu)式為：

該結(jié)構(gòu)式是新的結(jié)構(gòu)。由于缺少碳譜和二維譜圖，所以該化合物的結(jié)構(gòu)式還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵液中清除自由基活性成分的分離，得出兩種純化合物L(fēng)WZf和LWZc，通過(guò)對(duì)LWZf和LWZc的結(jié)構(gòu)式進(jìn)行分析，化合物L(fēng)WZf為對(duì)羥基苯甲酸，是一種代表性酚酸類物質(zhì)，能抗氧化、清除氧自由基。盡管LWZf為一已知化合物，但從樺褐孔菌中分離得到該化合物是首次報(bào)道。通過(guò)對(duì)化合物L(fēng)WZc可能的結(jié)構(gòu)式的推測(cè)，該化合物結(jié)構(gòu)可能是一種新的結(jié)構(gòu)，化合物L(fēng)WZc的純品清除自由基的能力相對(duì)較弱，可能是因?yàn)榇謽又泻衅渌煞趾碗s質(zhì)的協(xié)同作用，也可能是在分離的過(guò)程中活性成分被氧化。

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