黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)的提取分析及其抗氧化活性的研究

趙 鑫，趙雅娉，周大勇，劉 麗，啟 航，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116034；3.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司技術(shù)研發(fā)中心，遼寧大連116000）

近年來，營養(yǎng)型脂肪酸對于人類的健康作用引起了人們的廣泛關(guān)注[1]，研究發(fā)現(xiàn)長鏈的n-3多不飽和脂肪酸具有廣泛的健康益處，包括改善心臟疾病，促進幼兒發(fā)育，降低腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，抑制炎癥、血小板聚集、高血壓、高脂血以及較好地改善胰島素敏感性[1-2]。海產(chǎn)品富含二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），一直被視為健康食品，盡管需求量增加，但人均水產(chǎn)品供應(yīng)已趨于穩(wěn)定[3]。研究表明，海產(chǎn)品的組織中具有非常相似的脂肪酸組成[4]。因此，雖然海產(chǎn)品廢棄物不適合直接用于人類飲食消費，但卻成為潛在生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的原料。

酶解技術(shù)已用于魚的副產(chǎn)物制備蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)等物質(zhì)[5-6]。課題組在前期研究中已經(jīng)應(yīng)用酶解技術(shù)從貝類的副產(chǎn)物中制備了多糖、多肽和脂質(zhì)等有效成分[7-9]。其中，制備的貝類內(nèi)臟脂質(zhì)含有豐富的EPA和DHA[10]。近年來，也有從魚、蝦、貝等海產(chǎn)品的頭部和內(nèi)臟中提取脂質(zhì)的相關(guān)研究[5-6，11]。

黃海海燕（Asterina pectinifera）是棘皮動物，主要分布于我國的黃、渤海海域。由于黃海海燕是肉食性的動物，常對沿海經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖造成危害。在遼寧和山東沿海，捕獲的黃海海燕常作為廢棄物丟棄，造成資源浪費和一定程度的環(huán)境污染。因此黃海海燕的綜合開發(fā)利用，對于充分利用海洋生物資源、保護環(huán)境都有一定的現(xiàn)實意義。黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)的相關(guān)研究國內(nèi)外鮮見報道，本文以黃海海燕內(nèi)臟為原料，應(yīng)用酶解輔助有機溶劑提取技術(shù)制備脂質(zhì)，分析脂質(zhì)的脂肪酸組成，并研究了脂質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃海海燕（Asterina pectinifera） 大連太平洋海珍品有限公司；Changliver細(xì)胞 大連醫(yī)科大學(xué)；中性蛋白酶（60，000U/g）和堿性蛋白酶（40，000U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶（57，000U/g）和木瓜蛋白酶（39，000U/g） 生工生物（上海）有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；CCK-8日本同仁化學(xué)株式會社；其余試劑 為國產(chǎn)優(yōu)級純或分析純試劑。

RC-6 plus型冷凍離心機、ZKBTES-55型真空冷凍干燥機 美國Virtis；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司；DN-12A型氮氣吹干儀 天津市樂康科技有限公司；酶標(biāo)儀 瑞士Tecan Infinite；UV-2100型紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱日本三洋；精密pH計 上海雷磁儀器廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 新鮮黃海海燕，清水洗凈后，取出內(nèi)臟部分，經(jīng)冷凍干燥制成干粉，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水解度測定 蛋白質(zhì)的水解度DH（Degree of hydrolysis）代表蛋白質(zhì)在水解過程中，肽鍵被裂解的程度或百分比，數(shù)學(xué)表達式為：DH（%）=被裂解的肽鍵數(shù)/原蛋白質(zhì)中的總肽鍵數(shù)×100或者表達為DH（%）=α-氨基氮/總氮×100。用凱氏定氮法測定總氮含量，甲醛滴定法測定α-氨基氮含量[12-13]。

1.2.3 索氏提取法提取脂質(zhì) 取凍干后的樣品，用索氏抽提法提取脂質(zhì)。提取溶劑為乙醚，提取時間6h，水浴溫度控制在60℃左右，提取劑5m in回流1次。提取完成后，35℃下，用氮氣儀吹干乙醚，得到內(nèi)臟脂質(zhì)，稱重，冷凍避光保存。

1.2.4 酶輔助有機溶劑提取脂質(zhì) 黃海海燕內(nèi)臟干粉放置于樣品瓶中，加入4倍體積的去離子水，調(diào)節(jié)pH到最適反應(yīng)值，加入適量的堿性蛋白酶（Alc）、中性蛋白酶（Neu）、木瓜蛋白酶（Pap）和胰蛋白酶（Try）（各種酶的特性如表1所示），使其含量為2500U/g底物，在最適溫度下振蕩保溫3h，100℃的沸水中將酶滅活10m in，冷卻到室溫后，冷凍干燥，加入與去離子水等體積的正己烷，振蕩，離心，取上層正己烷層，將其裝入已經(jīng)稱量好的稱量瓶中，經(jīng)氮吹儀將正己烷吹干，稱量，得到提取脂質(zhì)的質(zhì)量。脂質(zhì)得率的計算公式為：

表1 4種蛋白酶的特性Table1 Parameters of 4 kinds of protease

1.2.5 脂肪酸組成分析

1.2.5.1 不可皂化物的分離提取 取100mg脂質(zhì)樣品，加入2.5m L 50%的KOH溶液，5m L 95%的乙醇，充分混勻。充氮氣密封，60℃水浴2h，皂化至溶液澄清透明，油滴消失為止（加熱過程中充分?jǐn)嚢瑁?。取出冷卻至室溫。向皂化混合液中加入3～4m L正己烷，振蕩萃取除去不可皂化物，反復(fù)6次[14-15]。

1.2.5.2 可皂化物的分離提取 在剩余皂化物混合液中滴加6mol/L的HCl，調(diào)至強酸性（pH＜1.0），再加入4m L正己烷，振蕩萃取可皂化物，反復(fù)6次，水洗至中性，氮吹至恒重，充氮，低溫保存[14-15]。

1.2.5.3 脂肪酸的甲酯化 以正己烷溶解皂化物干樣，從中取2.5mg樣品，加入2m L 1%硫酸-甲醇溶液（硫酸∶甲醇=1∶99（v/v）），充分混勻，充氮密封，70℃水浴加熱1h。然后取出冷卻至室溫，加入1m L水后，收集上層液相。水洗至中性，然后用正己烷調(diào)至可皂化物濃度為10mg/m L，加入無水硫酸鈉，充氮，低溫保存[14-15]。

1.2.5.4 GC-MS分析 將脂肪酸甲酯樣品稀釋為10mg/m L，使用安捷倫6890N GC-5973 MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀進行分析。色譜柱為HP-5-MS毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），初始溫度50℃，保持1m in；以50℃/min速度升至170℃；再以4℃/min升至300℃；以40℃/m in升至320℃，保持3.6m in。進樣體積為1.0μL，分流比為50∶1，使用氦氣為載氣。質(zhì)譜分析采用EI源70eV，選取Scan模式，掃描范圍為50～550m/z，溶劑延遲4m in。根據(jù)GC-MS中各組分保留時間以及質(zhì)譜圖，通過脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和NIST02庫檢索進行鑒定，用峰面積歸一法計算各脂肪酸的組成[16-17]。

1.2.6 細(xì)胞氧化損傷保護作用的分析 采用CCK-8比色法測定對H2O2致細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護作用。取對數(shù)生長期的Changliver細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）配成細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105個/m L。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔添加188μL細(xì)胞懸液，再加入配制好的不同濃度的脂質(zhì)2μL（脂質(zhì)溶解在DMSO中），混勻。培養(yǎng)24h，向各孔加入10μL H2O2（150μg/m L）。對照組中加入等體積DMSO。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每孔加入CCK-8 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，用酶標(biāo)儀于450nm測OD值。細(xì)胞存活率計算公式為：

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗都重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用SPSS統(tǒng)計軟件（16.0版，IBM，美國）對所有數(shù)據(jù)做方差分析并用LSD法對數(shù)據(jù)間做多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶輔助有機溶劑法提取黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)

由索氏提取法測得黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)含量為16.0%±0.80%，略低于扇貝內(nèi)臟的脂質(zhì)含量（23.70% ±0.60%）[10]和鮑魚內(nèi)臟的脂質(zhì)含量（20.87%±0.76%）[18]。由于黃海海燕原料低成本和相對較高的脂質(zhì)含量，可以成為脂質(zhì)制備工業(yè)潛在的可開發(fā)資源。

正己烷是脂質(zhì)制備工業(yè)中最常用的有機溶劑[19]，本課題組以之為浸提溶劑提取扇貝[10]、鮑魚[18]內(nèi)臟油脂，獲得較好的效果。有報道認(rèn)為底物的水解度是影響酶輔助水提取法脂質(zhì)得率的一個關(guān)鍵因素[20]。因此，推斷底物的水解度也可能影響酶輔助有機溶劑提取黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)的得率。

本研究選擇了4種蛋白酶水解黃海海燕的內(nèi)臟，水解后的樣品用于脂質(zhì)的提取。4種酶水解底物的水解度和脂質(zhì)的得率如圖1所示，堿性蛋白酶組（A lc）、中性蛋白酶組（Nue）、木瓜蛋白酶組（Pap）和胰蛋白酶組（Try）輔助有機溶劑法提取的脂質(zhì)得率分別為6.1%±0.02%、6.77%±0.06%、7.96%±0.04%和5.48%± 0.02%；脂質(zhì)的得率隨著底物水解度的增大而顯著提高，其中，木瓜蛋白酶（Pap）組的脂質(zhì)得率最大。該結(jié)果與有機溶劑提取的脂質(zhì)得率隨著底物的水解度提高而增大的結(jié)果相一致[21-22]。其主要的原因是蛋白酶破壞纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，使嵌入在其中的脂肪球釋放，有助于有機溶劑的提取[23]。

圖1 不同酶輔助有機溶劑提取黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)的水解度及脂質(zhì)得率Fig.1 Profiles of the degree ofhydrolysis values and lipid yields by differentenzyme assisted solvent extractionmethod

2.2 酶輔助有機溶劑法提取黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)的脂肪酸組成

如表2所示，GC-MS法在4種酶輔助有機溶劑法提取的脂質(zhì)中檢測到17種脂肪酸，但各脂肪酸含量存在一定差異。4種油脂中，總多不飽和脂肪酸均占總脂肪酸的40%以上，其中Try組的總多不飽和脂肪酸含量為40.84%±0.14%，顯著低于其他3組（p＜0.05），其他三組總多不飽和脂肪酸含量均在47%以上，并且其他三組含量之間不存在顯著性差異（p＞0.05）。在多不飽和脂肪酸中，EPA和DHA的含量分別占總脂肪酸含量的23%和3.8%以上，其中A lc組、Neu組和Pap組中的EPA含量均在30%以上，顯著高于Try組的EPA含量（p＜0.05）；而A lc組的DHA含量最高，達到6.85%±0.22%，顯著高于其他3組（p＜0.05）。另外4種酶輔助有機溶劑法提取的脂質(zhì)中，花生四烯酸（AHA）的含量也相對較高，占到總脂肪酸的8%以上，其中Pap組的AHA含量最高，達到10.76%±0.040%，顯著高于其他3組（p＜0.05）。

黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸含量高于海膽[8]和鮑魚[18]內(nèi)臟中多不飽和脂肪酸的含量（海膽34.7%～37.4%，鮑魚21.38%），而略低于扇貝中多不飽和脂肪酸的含量（55.44%）。其中EPA和DHA含量占總多不飽和脂肪酸的68%以上，其含量高于海膽（EPA，9.7%～10.9%；DHA，0.1%）[8]和鮑魚內(nèi)臟（EPA，7.08%；DHA，未檢出）[18]中的相應(yīng)含量，但DHA含量略低于扇貝內(nèi)臟[10]中的DHA含量（8.51%）。另外黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)中AHA的含量也相對較高，與鮑魚內(nèi)臟脂質(zhì)中AHA的含量相似（9.32%）[18]，但明顯高于海膽（6.3%～7.4%）[8]和扇貝內(nèi)臟（未檢出）[10]脂質(zhì)中AHA的含量。海膽、扇貝、鮑魚、藻類都是海洋中富含不飽和脂肪酸的生物，黃海海燕的體內(nèi)可能無法合成某些不飽和脂肪酸（例如AHA），所以通過攝食沿海的海珍品來獲得維持其自身的營養(yǎng)。這可能就是黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸含量相對較高的原因之一。

2.3 脂質(zhì)對細(xì)胞氧化損傷的保護作用

考察了應(yīng)用4種蛋白酶輔助有機溶劑法提取黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)對過氧化氫引起Changliver細(xì)胞氧化損傷的保護作用。如圖2所示，4種酶輔助有機溶劑法提取的脂質(zhì)在30～100μg/m L濃度下，都顯著抑制了過氧化氫引起的細(xì)胞損傷，其抑制效果隨濃度的升高而明顯增強。該結(jié)果表明，黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)具有一定的細(xì)胞抗氧化活性，與Chaung等報道的多不飽和脂肪酸保護了氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷結(jié)果相一致[24]。多不飽和脂肪酸對細(xì)胞氧化損傷的保護作用可能是通過激活抗氧化酶[25]、調(diào)節(jié)分子的表達[26]以及與氧化物質(zhì)反應(yīng)[27]等實現(xiàn)的。

圖2 酶輔助有機溶劑法提取黃海海燕內(nèi)臟脂質(zhì)的對細(xì)胞氧化損傷的保護作用Fig.2 Protective effecton cellular oxidative damage of lipidfrom starfish viscera by differentenzyme assisted solvent extractionmethod

3 結(jié)論

采用酶輔助有機溶劑法提取海燕內(nèi)臟脂質(zhì)，脂質(zhì)得率隨著底物水解度的增加而提高；海燕內(nèi)臟脂質(zhì)中多不飽和脂肪酸含量較高，可占總脂肪酸的40%以上，其中EPA和DHA可占總多不飽和脂肪酸的68%以上；海燕內(nèi)臟脂質(zhì)在30～100μg/m L濃度下都可以顯著抑制過氧化氫引起的細(xì)胞氧化損傷，具有一定的抗氧化活性?？梢?，作為海產(chǎn)廢棄物的黃海海燕，可作為提取長鏈的n-3多不飽和脂肪酸的潛在資源，有希望實現(xiàn)變廢為寶。

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