黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的功能特性

鄧芝串，張 超，張 暉，陸曉婷，王 立，錢海峰，齊希光

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京100097；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

籽瓜又稱“打瓜”，外形與西瓜相似但比西瓜略小，味淡。籽瓜屬葫蘆科普通西瓜亞種的變種，分為黑籽瓜和紅籽瓜兩種，我國(guó)籽瓜主要產(chǎn)區(qū)為吉林、山西、內(nèi)蒙古等地，年產(chǎn)量為百萬(wàn)噸以上[1]。籽瓜種子中蛋白質(zhì)的含量36%～40%，其蛋白質(zhì)含有豐富的必須氨基酸，除了賴氨酸外，其他幾種必需氨基酸均達(dá)到或超過(guò)FAO（聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[2-3]，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，在食品加工領(lǐng)域有著廣闊的開(kāi)發(fā)前景。以往，對(duì)籽瓜種子的研究多集中在促進(jìn)其萌芽方法和其健康生產(chǎn)上。近年來(lái)，對(duì)籽瓜種子中油脂的研究也逐漸的展開(kāi)，籽瓜種子中油脂的含量為45%左右，主要成分為亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，亞油酸是人體無(wú)法合成的必需脂肪酸，具有降血壓、調(diào)血脂，防止動(dòng)脈硬化等功效[4]。張超等也采用水酶法優(yōu)化了籽瓜種子中油脂的提取工藝[5]。但是對(duì)籽瓜種子中另一種重要成分——蛋白質(zhì)的研究則較少，只有張玉秀等對(duì)其氨基酸和脂肪酸組成進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)和比較[2]、張超等優(yōu)化水酶法提取籽瓜種子蛋白質(zhì)的工藝[6]。本文以黑籽瓜種子為原料，采用堿溶酸沉法進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，制備黑籽瓜種子蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白的熱變性溫度，并系統(tǒng)的研究pH、NaCl濃度和溫度對(duì)蛋白功能特性的影響，不僅能為黑籽瓜種子蛋白在工業(yè)應(yīng)用中提供理論指導(dǎo)，而且為黑籽瓜種子蛋白的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑籽瓜種子 民籽一號(hào)，甘肅省民勤縣金谷源農(nóng)業(yè)科技有限公司；福臨門一級(jí)大豆油 中糧集團(tuán)；氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、SDS、正己烷等 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

CR21GⅢ高速冷凍離心機(jī)日本日立公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Laboconcor公司；Delta 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；Q200差示掃面量熱儀DSC 沃特世科技（上海）有限公司，配備TA Instruments-Waters LLC分析系統(tǒng)；T18 basic 19G分散乳化機(jī) 廣東IKA科學(xué)儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 黑籽瓜種子手工去皮、粉碎、過(guò)60目篩，以正己烷按照料液比為1∶4（w/v）浸提，進(jìn)行2～3次脫脂處理，經(jīng)干燥后，放入密封袋，冷藏備用。

1.2.2 黑籽瓜種子基本成分的測(cè)定 水分含量的測(cè)定：GB/T 5009.3-2010采用常壓干燥法進(jìn)行；粗脂肪含量的測(cè)定：GB/T 5009.6-2003采用索氏提取法；灰分含量的測(cè)定：GB 5009.4-2010采用干法灰化法測(cè)定；粗蛋白含量的測(cè)定：GB/T 5009.5-2010采用凱氏定氮法進(jìn)行。

1.2.3 黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的制備 脫脂后的黑籽瓜種子粉末按1∶10（w/v）的料液比加入去離子水，用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)解pH至11.5，61.5℃條件下攪拌水浴浸提77m in，3500r/m in離心15m in，取上清液調(diào)節(jié)pH至5.0使蛋白沉淀，8000r/min離心15min得到蛋白沉淀，用去離子水洗滌沉淀2～3次，調(diào)節(jié)pH=7，冷凍干燥得到黑籽瓜種子蛋白質(zhì)[7]。

1.2.4 蛋白質(zhì)熱變性溫度的測(cè)定 用配備熱分析軟件（TA Instryments-Waters LLC）的差示掃描量熱儀（DSC）來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)的熱變性溫度。將蛋白質(zhì)按1∶4與去離子水混合，制成蛋白質(zhì)漿，4℃下平衡過(guò)夜。取一定量漿狀的蛋白質(zhì)置于儀器配套的鋁制堝內(nèi)，以5℃/m in的速率，從70℃升溫到110℃，進(jìn)行掃描測(cè)量，同時(shí)以空?qǐng)遄鰠⒈?。最后用儀器配套的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 溶解度的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[8]的方法，并做了適當(dāng)?shù)男薷?，具體方法如下：取0.1g蛋白質(zhì)溶解到10m L去離子水中，用0.5mol/L的HCl或0.5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)來(lái)得到不同的pH，在一定的溫度下攪拌30m in，每隔10min調(diào)一次pH，8000r/min離心30min，溶解度按式（1）計(jì)算。

1.2.6 持水性的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法，并做適當(dāng)?shù)母膭?dòng)，具體方法如下：取3g蛋白樣品與25m L的去離子水混合，每隔10m in攪拌一次，每次攪拌1m in，共攪拌6次。攪拌結(jié)束后3000r/m in離心25m in，將上清液移除，沉淀在50℃下干燥25m in稱重，持水性按式（2）計(jì)算。

1.2.7 持油性的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，并做適當(dāng)?shù)母膭?dòng)，方法如下：取0.5g蛋白樣品與6m L大豆油均勻混合，靜置30min，3000r/min離心25min，將上清液移除，沉淀稱重，持油性按式（3）計(jì)算。

1.2.8 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定，并做適當(dāng)?shù)男薷?，具體方法如下：取8m L的大豆油加入到24m L 0.1%的蛋白質(zhì)溶液中，10000r/min均質(zhì)1m in，形成均勻的乳液。在均質(zhì)后的0min和10min分別移取50μL的乳液，加入到一個(gè)含有5m L 0.1%SDS（w/v）溶液的試管中，用分光光度計(jì)在500nm處測(cè)定吸光值，乳化性及乳化穩(wěn)定性分別按式（4）和式（5）計(jì)算。

其中，T=2.303；C為蛋白質(zhì)溶液的濃度；?為油相的體積比；A0為0min時(shí)在500nm處的吸光值；A10為10m in時(shí)在500nm處的吸光值。

1.2.9 起泡性及起泡穩(wěn)定性的測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法測(cè)定，并做適當(dāng)修改，具體方法如下：取0.5g的蛋白質(zhì)溶于50m L的去離子水中，磁力攪拌30min，在分散機(jī)的程序3（大約10000r/m in）上均質(zhì)2m in，轉(zhuǎn)入100m L的量筒內(nèi)分別測(cè)量，0min泡沫的體積V0和30m in后泡沫的體積V30，起泡性和起泡穩(wěn)定性分別按式（6）和式（7）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑籽瓜種子主要成分的含量

黑籽瓜種子中各組分的含量如表1所示。

2.2 黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的熱變性溫度

圖1黑籽瓜種子蛋白的DSC圖譜中顯示兩個(gè)截然不同變性吸熱峰，其對(duì)應(yīng)的變性峰值溫度分別是84.79℃和100.72℃。與Chun Liu和Xian sheng Wang等[13]在2008年報(bào)道的大豆分離蛋白7S的變性溫度82.50℃和11S變性溫度98.95℃相比，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)具有相對(duì)較好的熱穩(wěn)定性。據(jù)A li Abas Wani和Dalbir Singh Sogi[11]在2011年報(bào)道西瓜種子蛋白的DSC圖譜也有兩個(gè)截然不同的兩個(gè)熱變性峰。

表1 黑籽瓜種子的主要成分Table1 Main components of black seed-watermelon seed kernel

圖1 黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的DSC圖譜Fig.1 Thermograms of black seed-watermelon seeds protein by DSC

2.3 黑籽瓜種子蛋白的溶解度

由圖2（A）可知，當(dāng)NaCl濃度小于1mol/L時(shí)，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的溶解度隨著NaCl濃度的增加而增加，而當(dāng)NaCl濃度大于1mol/L時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度隨著NaCl濃度的增加而減小。這是因?yàn)楫?dāng)NaCl濃度處于較低水平時(shí)，NaCl的存在使蛋白質(zhì)表面所帶電荷增加，與水分子的結(jié)合力增強(qiáng)，使蛋白質(zhì)的溶解度增加；然而當(dāng)NaCl濃度過(guò)高時(shí)，過(guò)量的NaCl會(huì)與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子，破壞蛋白的水化層，同時(shí)過(guò)量的NaCl離子又能中和蛋白表面的電荷，使原來(lái)穩(wěn)定的體系變的不穩(wěn)定，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低。

由圖2（B）可知，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的溶解度在等電點(diǎn)附近最低，只有1.5%。當(dāng)?shù)鞍滋幱谄x等電點(diǎn)的酸性或堿性環(huán)境時(shí)，其溶解度都呈增加趨勢(shì)，并且在堿性環(huán)境下的溶解度高于酸性環(huán)境下的溶解度。是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)處，蛋白質(zhì)表面所帶正負(fù)的電荷為零，蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力最弱，由于疏水相互作用使導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間聚集沉淀。

由圖2（C）可知，當(dāng)溫度處于30～80℃時(shí)，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的增加而增加。當(dāng)溫度大于80℃時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度降低。這是因?yàn)樵谳^低溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生輕微的改變，立體構(gòu)象伸展，與水分子之間的相互作用增強(qiáng)，溶解度增加，而由圖1可知，當(dāng)溫度大于80℃時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性，蛋白質(zhì)分子的立體構(gòu)象被破壞，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在分子表面，溶解度下降。

圖2 pH、NaCl濃度、溫度對(duì)溶解度的影響Fig.2 Effectof pH，NaCl concentration and temperature on solubility

2.4 黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水性

由圖3（A）可知，當(dāng)環(huán)境中NaCl濃度處于0～1.2mol/L時(shí)，黑籽瓜種子蛋白的持水性隨著NaCl濃度的增加而增加。當(dāng)NaCl濃度處于0～1.0mol/L時(shí)，發(fā)生“鹽溶”現(xiàn)象，增加了蛋白與水的相互作用，蛋白的持水性增大；而當(dāng)NaCl濃度處于1.0～1.2mol/L時(shí)，雖然此時(shí)鹽離子濃度過(guò)高，中和了蛋白表面的小部分電荷，略微破壞了一些水化層，使蛋白質(zhì)分子與水分子之間的親和力減弱，持水性下降，但過(guò)高的鹽離子能降低蛋白的溶解度，能減少溶于水而損失掉的蛋白的量，使沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)增加，使實(shí)測(cè)的持水性增加。

由圖3（B）可知，當(dāng)pH從酸性環(huán)境逐漸靠近等電點(diǎn)時(shí)，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水性逐漸降低，這是因?yàn)樵娇拷入婞c(diǎn)，蛋白質(zhì)分子表面所帶的正負(fù)電荷越少，與水分之間的作用力越弱，持水性越差；當(dāng)pH逐漸遠(yuǎn)離等電點(diǎn)而向堿性環(huán)境偏移時(shí)，蛋白質(zhì)的持水性先增加后降低，這是因?yàn)?，pH逐漸偏離等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)所帶的電荷不斷增加，與水分子之間的相互作用增強(qiáng)，持水性增加，但在較強(qiáng)的堿性環(huán)境下，雖然蛋白質(zhì)帶電荷增加，蛋白質(zhì)分子與水的相互作用增強(qiáng)，但是此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度大大的增加，使得實(shí)際測(cè)量持水性反而下降。

由圖3（C）可知，在20～80℃的溫度范圍內(nèi)，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的持水性隨著溫度的升高而增加。這是因?yàn)?，此時(shí)溫度雖然升高但未達(dá)到蛋白質(zhì)的變性溫度，升溫使蛋白質(zhì)空間立體結(jié)構(gòu)伸展，解離，有利于蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用，使持水性增加。

圖3 pH、NaCl濃度、溫度對(duì)持水性的影響Fig.3 Effectof pH，NaCl concentration and temperature on water-holding capacity

2.5 黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的持油性

圖4 溫度對(duì)持油性的影響Fig.4 Effect of temperature on oil-absorbing capacity

由圖4可知，當(dāng)在10～30℃時(shí)，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的持油性隨著溫度的升高而增加，30℃時(shí)持油性達(dá)到最高309.9g/100g；當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)持油性不斷下降，這是因?yàn)椋瑴囟仍黾?，油的粘度降低，流?dòng)性增加，蛋白質(zhì)與油之間的吸附作用減弱，從而降低了蛋白質(zhì)的持油性[14]。

2.6 黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)乳化性是指蛋白樣品與油水結(jié)合在一起，形成乳狀液的能力；乳化穩(wěn)定性是指油水乳化液保持穩(wěn)定的能力[15]。

由圖5（A）可知，當(dāng)NaCl濃度處在0～1.0mol/L的范圍內(nèi)，黑籽瓜種子蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性都隨著NaCl濃度的增加而增加，當(dāng)NaCl濃度為1.0mol/L時(shí)蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性均達(dá)到最大分別為84.39m2/g和59.04m in；當(dāng)NaCl濃度大于1.0mol/L時(shí)黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性均下降。原因是在低NaCl濃度下，參與乳化的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度大，由于電荷作用使蛋白質(zhì)之間的靜電斥力減小，使油滴更容易吸附在蛋白界面，但當(dāng)NaCl濃度過(guò)高時(shí)，鹽離子壓縮了膠體的擴(kuò)散雙電層，破壞了靜電復(fù)合物的形成，乳化能力下降[16]。

圖5 pH、NaCl濃度、溫度對(duì)乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effectof pH，NaCl concentration and temperature on emulsifying capacity and emulsion stability

由圖5（B）可知，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的乳化性在等電點(diǎn)附近最低，僅有12.28m2/g，乳化穩(wěn)定性反而最好，達(dá)到83.72min。pH對(duì)黑籽瓜種子蛋白質(zhì)乳化性的影響與pH對(duì)其溶解度的影響基本一致，這表明蛋白質(zhì)乳化性與溶解度有密切關(guān)系。

由圖5（C）可知，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性隨著溫度升高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，乳化性在40℃時(shí)達(dá)到最大值94.25m2/g，乳化穩(wěn)定性在60℃時(shí)達(dá)到最大值69.16min。溫度繼續(xù)上升會(huì)使黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性下降，其原因是過(guò)高的溫度會(huì)降低吸附在界面上的蛋白質(zhì)膜的黏度和硬度，因而乳化性和乳化穩(wěn)定性會(huì)降低[17]。

2.7 黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的起泡性及起泡穩(wěn)定性

由圖6（A）可知，當(dāng)NaCl濃度處于0～0.4mol/L的的范圍時(shí)，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的起泡性隨著NaCl濃度的增加而迅速增加，而當(dāng)NaCl濃度在0.4～1.2mol/L時(shí)蛋白質(zhì)起泡性逐漸趨于平穩(wěn)。而起泡穩(wěn)定性隨著NaCl濃度的增加先降低后增加。這是因?yàn)镹aCl的加入使得蛋白質(zhì)的溶解度、黏度、展開(kāi)和聚集狀態(tài)發(fā)生變化，因而能改變起泡性質(zhì)[18]。

圖6 pH、NaCl濃度、溫度對(duì)起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effectof pH，NaCl concentration and temperature on foaming capacity and foam stability

由圖6（B）可知，pH對(duì)黑籽瓜種子蛋白質(zhì)起泡性的影響與pH對(duì)其溶解度的影響趨勢(shì)基本一致，都呈“V”字型。蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性在等電點(diǎn)附近均處于最小值，且泡沫大小不均勻，消失特別快。而在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，特別是堿性范圍時(shí)泡沫細(xì)膩均勻，穩(wěn)定性較好。這是因?yàn)?，蛋白起泡性與溶解度有密切的關(guān)系，在等電點(diǎn)處蛋白質(zhì)聚集沉淀從而導(dǎo)致起泡性降低。而在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的酸堿環(huán)境中，蛋白質(zhì)表面帶有的正負(fù)，能增加蛋白溶解度和表面活性，從而使蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性均得到改善[19-20]。

由圖6（C）可知，在10～60℃的溫度范圍內(nèi)，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性都隨著溫度的增加而增加，并在60℃的時(shí)候達(dá)到最大值。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性均下降。這是因?yàn)?，適度的熱處理會(huì)使蛋白分子伸展程度增大，提高其在水中溶解性，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子向氣-液界面移動(dòng)；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)趨于熱變性，溶解度降低，另外高溫又會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)膜黏度降低、氣泡破裂和泡沫解體，從而降低了蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性[21]。

3 結(jié)論

黑籽瓜種子蛋白質(zhì)具有相對(duì)較高的熱變性溫度，熱穩(wěn)定性較好。NaCl濃度、pH、溫度等因素對(duì)黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)具有很大的影響：在較低的NaCl濃度范圍（0～1mol/L）內(nèi)，增加NaCl的濃度，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的各項(xiàng)功性質(zhì)均有明顯的改善，但當(dāng)NaCl濃度大于1mol/L時(shí)，繼續(xù)升高濃度，會(huì)降低蛋白質(zhì)的各項(xiàng)功能性質(zhì)；溫度對(duì)黑籽瓜種子蛋白質(zhì)不同性質(zhì)的影響不同，但是蛋白的各項(xiàng)功能性質(zhì)都隨著溫度的升高先提高后降低，在50～60℃范圍左右達(dá)到相對(duì)較好的狀態(tài)，但當(dāng)溫度高于80℃后，繼續(xù)升高溫度，蛋白質(zhì)的各項(xiàng)功能性質(zhì)均下降；pH對(duì)黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的各項(xiàng)功能性質(zhì)影響顯著；在等電點(diǎn)4.5附近，除了乳化穩(wěn)定性較好之外，黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的各項(xiàng)功能性質(zhì)均較差，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，各種功能性質(zhì)均得到改善。本實(shí)驗(yàn)探究了pH、溫度和NaCl濃度對(duì)黑籽瓜種子蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響，結(jié)果不僅可以應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，改善黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的加工特性，還可以為深入研究黑籽瓜種子蛋白質(zhì)的功能特性提供可靠依據(jù)。

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