高效液相色譜法同時測定羊肉中的11種鎮(zhèn)靜劑類藥物

魏晉梅，羅玉柱，*，白云旭

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學研究測試中心，甘肅蘭州730070；2.甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院，甘肅蘭州730070）

鎮(zhèn)靜劑（sedative）是指能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生輕度抑制，減弱機能活動，從而起到消除躁動不安、恢復安靜的一類藥物。近年來，個別畜牧業(yè)飼養(yǎng)者因經(jīng)濟利益的驅(qū)使，擅自在畜禽飼養(yǎng)過程中添加此類藥物以起到鎮(zhèn)靜催眠、增重催肥、縮短出欄時間的作用；另外，在動物運輸過程中，為減少動物死亡和體重下降，防止肉品質(zhì)降低，也常使用此類藥物以減少應(yīng)激帶來的損失[1]。非法使用此類藥物會使其原形和代謝產(chǎn)物不可避免地殘留于動物源食品中，人們食用了這些食品后，肝臟負擔加重，頭腦長期昏沉，記憶受影響，同時運動神經(jīng)和肌肉功能受到抑制，因此許多國家都將此類藥物列為禁用藥物。我國農(nóng)業(yè)部第193號公告規(guī)定嚴禁在動物飼料和飲用水中使用此類藥物，在動物源食品中不得檢出此類藥物[2]。

目前，檢測鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS-MS）[3-9]、液相色譜法（HPLC）[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[12-13]等。國標規(guī)定檢測此類藥物用液-質(zhì)聯(lián)用法[14-15]，但這種方法投資大、成本高，很多實驗室條件不具備。本文建立了羊肉中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量的液相色譜檢測方法，該方法檢測成本低、靈敏度高、回收率高，能滿足大多數(shù)實驗室檢測的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肉樣品 購自桃海市場（蘭州）；對照品：唑吡坦（171258-200601）、氟哌啶醇（100313-200301）、氯氮卓（171248-200301）、氯丙嗪（100460-200501）、奮乃靜（100133-200602）、氟奮乃靜（100162-201003）、奧沙西泮（171229-201104）等 購自中國藥品生物制品檢定所；甲苯噻嗪（11010，純度≥98.0%）、丙酰丙嗪（10404，純度≥99.0%）、咔唑心安（00421，純度≥99.0%）等 Dr.Ehrenstorfer公司標準品（德國）；氟哌利多（CDCU-1229001） USP標準品；甲醇 為色譜純試劑，購自DIKMA公司（美國）；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

Agilent1100 series液相色譜儀 配有二元泵、DAD檢測器，美國Agilent公司；AB104-N電子天平 Mettler Toledo公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州市亞榮儀器有限公司；SUPRA 22K高速離心機 韓國Hanil公司；KH3200B型超聲波清洗器 功率150W，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取新鮮羊肉背最長肌100g，切碎后混合、均質(zhì)，于-18℃冷凍保存、備用。

提?。喝【|(zhì)樣品5.0g于50m L具塞離心管內(nèi)，加入15m L 1%氨水-乙腈溶液，超聲提取10m in，4000r/m in離心5m in，移出上清液，重復上述步驟2次，合并上清液。向上清液中加入5.0g NaCl，充分混合，靜置5m in，移除上清液，于35℃減壓濃縮至近干，加入1m L甲醇溶液，渦旋至瓶內(nèi)殘渣全部溶解下來，過0.22μm有機相濾膜后，進HPLC分析測定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（250mm×4.6mm，5μm）；以甲醇（A）-0.1%甲酸（B）為流動相進行梯度洗脫（0～8min，90%B→55%B；8～13min，55%B→5%B；13～25min，5%B→90%B）；流速0.8m L/min；柱溫25℃；檢測波長245nm、254nm；自動進樣器樣品室溫度25℃，進樣量10μL。

1.2.3 標準溶液制備 分別準確稱取唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、氯丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜、奧沙西泮、甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、氟哌利多等11種標準品10.00mg，用甲醇溶解，并定容至50m L的棕色容量瓶中，制成標準儲備液。此儲備液中11種標準品的濃度為200μg/m L。使用前用甲醇將此儲備液稀釋至所需濃度，配制成標準工作液和標準混合工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

本實驗嘗試了分別用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、0.1%氨水-乙腈、甲醇-乙酸乙酯（v/v，1∶1）等試劑對樣品進行提取。甲醇、乙酸乙酯和甲醇-乙酸乙酯提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時呈非常渾濁、粘稠狀，用甲醇洗脫，經(jīng)C18小柱凈化后，溶液澄清，但放置過夜后溶液中有絮狀物；乙腈和0.1%氨水-乙腈提取液較澄清，但乙腈提取液的回收率低。原因可能是氯氮卓、奧沙西泮屬于苯二氮卓類藥物，唑吡旦是咪唑并吡啶類藥物，氯丙嗪是吩噻嗪類藥物。苯二氮卓類藥物具有類似的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且大多數(shù)呈中性或弱堿性，因此在弱的酸性或堿性條件下即可被有機溶劑提取出來。吩噻嗪類藥物屬于脂溶性藥物，在堿性條件下易溶于有機溶劑。因此，本實驗選用0.1%氨水-乙腈作為提取溶劑。另外，實驗中用了HLB和C18小柱兩種固相萃取柱對提取液進行凈化，結(jié)果表明兩種小柱的凈化效果沒有明顯差異。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別用甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫。實驗過程中發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸作為流動相時，有些藥物同時出峰或出雙肩峰，分離效果不好。甲醇-0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫，11種藥物都能很好地分離，便于定性、定量。在190～380nm進行波長掃描后發(fā)現(xiàn)，254nm時各藥物都有很好的響應(yīng)，但甲苯噻嗪、唑吡坦、咔唑心安、氟哌利多、氯氮卓、丙酰丙嗪、氟哌啶醇、奧沙西泮等8種藥物在245nm的響應(yīng)值更高，因此，選擇254nm作為氯丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜3種藥物的檢測波長，其他8種藥物的檢測波長為245nm（圖1）。

2.3 標準曲線的制備

用甲醇將標準儲備液稀釋成一系列不同濃度的標準工作液，依次進HPLC分析，以峰面積對濃度進行線性回歸，得到11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表1）。以信噪比（S/N）等于3為標準，測得11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的檢出限（表1）。甲苯噻嗪、唑吡坦、咔唑心安、氟哌啶醇、氯氮卓、丙酰丙嗪、氯丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜在0.02～200μg/m L范圍有良好的線性關(guān)系，奧沙西泮在0.005～200μg/m L范圍有良好的線性關(guān)系，氟哌利多在0.05～200μg/m L范圍有良好的線性關(guān)系。

表1 11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的線性回歸方程及檢出限Table1 Linear functions and detection limit of 11 sedatives

2.4 方法的回收率與精密度

在空白樣品中加入標準工作液，按1.2.1方法制備樣品，平行測定六次，將測得的峰面積代入回歸方程，計算各鎮(zhèn)靜劑類藥物的含量，并計算出平均加標回收率，結(jié)果見表2。11種藥物的平均回收率在64.0%～121.3%，相對標準偏差小于20%。

圖1 11種鎮(zhèn)靜劑類藥物在選定色譜條件下的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 11 sedatives by HPLC

表2 方法的回收率和精密度Table2 Spiked recoveries and precision of 11 sedatives in blank samples

3 結(jié)論

本文建立了羊肉中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物的HPLC測定方法，以甲醇-0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫，采用245nm和254nm兩個波長進行檢測，11種藥物得到了很好的分離和較強的吸收。該方法回收率高、精密度好，能夠滿足大多數(shù)實驗室的檢測需求。

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