紫外分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定M aillard體系中抗壞血酸含量的比較

唐樂攀，周永妍，余愛農(nóng)，*

（1.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施445000；2.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北恩施445000）

Maillard反應(yīng)是食品加工和儲(chǔ)藏過程中最重要的反應(yīng)之一[1]，其主要是指羰基化合物與氨基化合物（包括氨基酸、低肽物質(zhì)、蛋白質(zhì)等）之間發(fā)生的非酶褐變反應(yīng)。而抗壞血酸（VC）作為另一個(gè)在Maillard反應(yīng)中引起廣泛注意的具有潛在羰基組分的化合物[2]，廣泛存在于各種水果、蔬菜中，而且在食品工業(yè)中常用作食品添加劑。因此從食品科學(xué)的角度上講，在Maillard體系中測(cè)定抗壞血酸的含量，對(duì)評(píng)價(jià)食品品質(zhì)以及深入了解Maillard反應(yīng)有著重要的意義。

目前所報(bào)道的關(guān)于抗壞血酸檢測(cè)的方法很多，主要包括碘量法[3]、雜多酸法[4]、熒光法[5]、紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法[7-8]，其中，碘量法、雜多酸法、熒光法需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，滴定終點(diǎn)通常難以確定或操作較繁瑣，易產(chǎn)生誤差。紫外分光光度法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，但樣品較復(fù)雜時(shí)易受其他組分紫外吸收的干擾。高效液相色譜法測(cè)定精確，但是運(yùn)行成本較高，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)。眾所周知，Maillard反應(yīng)產(chǎn)物極其復(fù)雜，且反應(yīng)后體系為深棕色，反應(yīng)中間體或產(chǎn)物以及深棕色溶液是否會(huì)對(duì)VC的檢測(cè)產(chǎn)生干擾不得而知。本文擬比較研究紫外分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定Maillard體系中VC的含量，旨在找到一種適合此體系的VC檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-抗壞血酸、L-半胱氨酸、偏磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉 均為分析純；甲醇 為色譜純，以上均來自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 均為雙重蒸餾水。

UV2550紫外-可見光分光光度計(jì)日本島津公司；1260高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；PB-21 pH計(jì)、BS-124S電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；P160001厚壁耐壓瓶 北京欣維爾玻璃儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外分光光度實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用電子天平準(zhǔn)確稱取10.0mg抗壞血酸并小心移至100m L棕色容量瓶中，用3%的偏磷酸溶液溶解，并稀釋至刻度，配制成0.1mg/m L母液備用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4、4.0、5.0、10.0m L母液于10m L容量瓶中，用3%偏磷酸溶液稀釋至刻度，混合均勻。此抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度為0、2、4、6、8、10、14、18、22、26、30、34、40、50、100μg/m L。以3%的偏磷酸溶液為參比，在VC最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列抗壞血酸溶液的吸光度。

1.2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在200～400nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，繪制吸收光譜曲線圖。

1.2.1.3 反應(yīng)液的制備 據(jù)文獻(xiàn)[9]，將0.1761 g（0.001mol）L-抗壞血酸和0.1211g（0.001mol）L-半胱氨酸溶解于10m L 0.2mol/L pH=8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，再用適量NaOH將pH調(diào)至8并裝入厚壁耐壓反應(yīng)瓶中密封。在（140±1）℃下攪拌反應(yīng)2h后，取出快速冷卻。反應(yīng)三份作為平行樣。

1.2.1.4 樣品的測(cè)定 取25.0μL反應(yīng)液，用3%的偏磷酸溶液稀釋至50m L搖勻，以3%的偏磷酸溶液作為參比溶液，在VC最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度。

1.2.2 高效液相色譜實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 色譜條件 C18色譜柱；二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相：由A、B、C三組分組成，A為水，B為甲醇，C為3%的偏磷酸溶液；流速為1.0m L/m in；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL；梯度洗脫[10]見表1。

表1 梯度洗脫表Table1 Gradientelution program

1.2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 將VC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣并進(jìn)行全波段掃描，繪制吸收光譜曲線圖。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取100.0mg抗壞血酸并小心移至100m L棕色容量瓶中，用3%的偏磷酸溶液溶解，并稀釋至刻度，配制成1.0mg/m L母液備用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L母液，用3%偏磷酸溶液稀釋至10m L，混合均勻。此抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/m L。

1.2.2.4 樣品的測(cè)定 使用1.2.1.3的方法制備樣品后，取30μL反應(yīng)液，用3%的偏磷酸溶液稀釋至10m L搖勻后，過0.45μm濾膜，在上述色譜條件和VC最大吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度法

2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定 根據(jù)繪制吸收光譜曲線圖，得到VC在紫外可見光-分光光度計(jì)中最大吸收波長(zhǎng)為243nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及工作曲線的確定 測(cè)定抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的吸光度，結(jié)果見表2。

圖1 0～50μg/mL線性曲線Fig.1 Linearity curve of 0～50μg/mL

圖2 0～100μg/mL線性曲線Fig.2 Linearity curve of 0～100μg/mL

表2 VC標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度Table2 Absorbance of VC standard solution

以抗壞血酸濃度C對(duì)吸光度A作圖，當(dāng)濃度最高為50μg/m L時(shí)，線性回歸方程為A=0.05547C-0.02042，相關(guān)系數(shù)R=0.9999，如圖1所示。當(dāng)濃度增加到100μg/m L時(shí)，如圖2所示，線性回歸方程為A=0.04556C +0.15501，相關(guān)系數(shù)R=0.9893，說明濃度過高，曲線彎曲，導(dǎo)致吸光度與濃度線性關(guān)系下降。

表3 紫外分光光度法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table3 Spiked Recoveries by UV spectrophotometry

表4 HPLC法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table4 Spiked Recoveries by HPLC

但是，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般認(rèn)為紫外分光光度儀測(cè)量時(shí)吸光度最大不要超過0.8，否則濃度過高容易造成曲線彎曲或者因?yàn)閮x器本身?xiàng)l件造成誤差。因此我們以0～14μg/m L作為VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線，同樣以抗壞血酸濃度C對(duì)吸光度A作圖，得到線性回歸方程A= 0.05457C-0.01336，相關(guān)系數(shù)R=0.9998，結(jié)果見圖3。

圖3 紫外分光光度法VC工作曲線Fig.3 Working curve of VC standard solution

2.1.3 方法的檢出限 將基線放大，得到最大噪聲值為0.003，以3倍信噪比為定性檢出限，10倍信噪比為定量檢出限，代入線性回歸方程，得到定性檢出限為0.368μg/m L，定量檢出限為0.757μg/m L。

2.1.4 回收率實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)方法，分別對(duì)3個(gè)平行樣中的抗壞血酸含量進(jìn)行測(cè)定，然后加入同濃度抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品，再按照上述方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，回收率在107%～118%之間，表明紫外分光光度實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)VC具有較好的準(zhǔn)確性。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定 根據(jù)繪制的吸收光譜曲線圖，結(jié)果VC在252nm處有最大吸收波長(zhǎng)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 測(cè)定252nm波長(zhǎng)下抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的峰面積。以峰面積Y對(duì)抗壞血酸濃度C作圖，得到線性回歸方程Y=25916.5C-36.29，相關(guān)系數(shù)R=0.9998。結(jié)果見圖4。

2.2.3 回收率實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)方法，分別對(duì)3個(gè)平行樣中的抗壞血酸含量進(jìn)行測(cè)定，然后加入同濃度抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品，再按照上述方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，回收率在95.3%～106%之間，表明HPLC檢測(cè)VC具有良好的準(zhǔn)確性。

圖4 高效液相色譜VC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of VC by HPLC

2.3 反應(yīng)液的檢測(cè)結(jié)果

分別使用兩種方法對(duì)同樣三個(gè)平行樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，在根據(jù)不同稀釋程度換算得到原反應(yīng)液中抗壞血酸濃度，結(jié)果分別見表5、表6。

表5 紫外分光光度法測(cè)定三個(gè)平行樣結(jié)果Table5 Determination results of 3 parallel samples by UV spectrophotometry

表6 HPLC法測(cè)定三個(gè)平行樣結(jié)果Table6 Determination results of 3 parallel samples by HPLC

2.4 檢測(cè)結(jié)果分析

將VC標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品高效液相色譜圖相比較不難發(fā)現(xiàn)，樣品色譜圖中只有一個(gè)大峰，保留時(shí)間為1.195s，與標(biāo)準(zhǔn)溶液中VC的保留時(shí)間1.216s在誤差范圍之內(nèi)，說明樣品在VC最大吸收波長(zhǎng)下有紫外吸收的只有VC一種物質(zhì)，而Maillard反應(yīng)中間體及產(chǎn)物均沒有吸收，證明了使用紫外分光光度法在VC最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)VC含量時(shí)，其他干擾較少。

圖5 VC標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of VC standard solution

圖6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of sample

究其原因，可能是因?yàn)镸aillard體系雖然復(fù)雜，包含種類繁多的中間體及產(chǎn)物，但是中間體活性很高，很快會(huì)繼續(xù)參與反應(yīng)[11]。而產(chǎn)物中風(fēng)味物質(zhì)相比于反應(yīng)底物來講，含量很小，對(duì)VC的檢測(cè)干擾忽略不計(jì)。最終聚合物類黑精，據(jù)相關(guān)測(cè)定反應(yīng)棕色指數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]，是用反應(yīng)液在420nm處的吸光值來表征，對(duì)于VC的紫外吸收也沒有干擾。

3 結(jié)論

比較兩種方法不難發(fā)現(xiàn)，雖然HPLC平均回收率更接近100%，方法更精確，線性范圍更廣，但是紫外分光光度法回收率在107%～118%之間，也具有良好的準(zhǔn)確性。分別使用兩種方法對(duì)3個(gè)平行樣進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，換算得到原反應(yīng)液中VC的含量相近，表明兩種方法誤差較小。樣品高效液相色譜圖中，其他組分峰面積可忽略不計(jì)，說明紫外分光光度法檢測(cè)Maillard體系中VC含量時(shí)，其他成分干擾可以忽略，且相比之下紫外分光光度法操作更為簡(jiǎn)單，快捷，適合Maillard體系中VC的檢測(cè)。

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