高效液相色譜法檢測蠶蛹油中主要脂肪酸的研究

崔志芳，彭奇均

（江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

蠶蛹是繅絲業(yè)的大宗副產(chǎn)物，蠶蛹油是從蠶蛹中提取的淡黃色至褐色油狀物[1]。亞麻酸、棕櫚酸、油酸是蠶蛹油中的主要脂肪酸。亞麻酸是人體必需的脂肪酸，在機(jī)體具有重要的生理功能，如調(diào)節(jié)血脂、改善心腦血管疾病、保護(hù)視力等[2]；棕櫚酸和油酸在化工和醫(yī)藥領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用[3]。

脂肪酸的檢測一般采用氣相色譜法，但分析過程中柱溫較高（＞180℃），易使不飽和脂肪酸的雙鍵斷裂或雙鍵異構(gòu)化，且該方法分析前需要對脂肪酸進(jìn)行甲酯化，甲酯化過程中脂肪酸可能生成不完全甲酯衍生物，也可能發(fā)生異構(gòu)化或者水解等反應(yīng)，導(dǎo)致測試結(jié)果準(zhǔn)確度不高[4-5]。高效液相色譜-熒光檢測法具有較高的靈敏度，但該方法也存在衍生試劑不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差、進(jìn)樣前處理操作繁瑣等缺點(diǎn)[6]。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）作為一種新型通用型檢測器，已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于化工、食品等領(lǐng)域[7]。HPLCELSD法分析檢測脂肪酸類化合物具有樣品無需前處理，分離效果好、靈敏度高和選擇性好等特點(diǎn)[8]。劉濤[9]建立了一種利用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測、通過梯度洗脫測定油脂中脂肪酸和甘油酯含量的方法，并考察了醋酸含量對色譜分離效果的影響。Mengesha A E[10]采用HPLC-ELSD法分析檢測卵磷脂水解產(chǎn)物中的游離脂肪酸，對亞油酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和回收率等進(jìn)行了考察。但HPLC-ELSD應(yīng)用于蠶蛹油脂肪酸的分析研究鮮有報(bào)道。

本研究采用HPLC-ELSD法分析蠶蛹油中的亞麻酸、棕櫚酸和油酸，考察色譜條件對三種脂肪酸分離效果的影響規(guī)律，以期建立簡便、可靠、適用性好的脂肪酸定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棕櫚酸、油酸、亞麻酸、乙酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、丙酮 色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 由Heal Force純水系統(tǒng)（利康發(fā)展有限公司）制備；蠶蛹油 四川自然而然生物分離有限公司。

Waters1525型高壓液相色譜儀、Waters2420型蒸發(fā)光散射檢測器 美國沃特世科技有限公司；HB230A型柱溫箱 漢邦科技有限公司；AL104電子分析天平 梅特勒-托利多中國地區(qū)；SK3300H型超聲波清洗儀 美國KUDOS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 稱取亞麻酸、棕櫚酸、油酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.1g，分別溶于25m L丙酮中，配制4.0mg/m L的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，分別將不同的脂肪酸儲(chǔ)備液稀釋后配成0.1、0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、2.5mg/m L等濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 蠶蛹油水解后脂肪酸樣品制備 取蠶蛹油水解樣品0.1g，精密稱定，配制成1.0mg/m L的樣品溶液，待測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Hanbon Lichrospher C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相A：丙酮；流動(dòng)相B：水（2%乙酸）；梯度洗脫程序：0～25min，65%A～80%A；流速：1.0m L/m in；柱溫；30℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測器參數(shù)：增益100，漂移管溫度50℃，霧化器級(jí)別50%，N2壓力25.0psi。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相對蠶蛹油中脂肪酸分離的影響

圖1 不同流動(dòng)相及洗脫方式下三種脂肪酸的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of differentmobile phase for the separation of 3 fatty acids

2.1.1.1 流動(dòng)相種類 通常用于分離脂肪酸的流動(dòng)相包括乙腈、甲醇、丙酮、異丙醇、氯仿，常用的組合有甲醇-水（1%乙酸）[11]、乙腈-水（0.1%乙酸）-二氯甲烷[12]。比較丙酮-乙腈、丙酮-甲醇、丙酮-水（丙酮80%）為流動(dòng)相時(shí)對三種脂肪酸的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)前兩種流動(dòng)相不能使棕櫚酸和油酸相互分離（圖1-a），亞麻酸與其他脂肪酸分離較好；采用后一種流動(dòng)相時(shí)，棕櫚酸和油酸色譜峰有分離趨勢但沒有實(shí)現(xiàn)基線分離，亞麻酸與其他脂肪酸分離較好（圖1-b）。故選擇丙酮-水為流動(dòng)相，進(jìn)一步考察不同流動(dòng)相配比對棕櫚酸和油酸分離效果的影響。

2.1.1.2 流動(dòng)相配比 首先考察不同比例丙酮-水為流動(dòng)相（丙酮80%、70%、60%）等度洗脫時(shí)，棕櫚酸和油酸分離的影響。發(fā)現(xiàn)降低丙酮濃度，兩種脂肪酸的分離度增加、響應(yīng)值減??；當(dāng)丙酮濃度為60%時(shí)，兩種脂肪酸仍沒有實(shí)現(xiàn)基線分離、響應(yīng)值達(dá)到最低。

其次考察丙酮（A）+水（B）為流動(dòng)相，以下梯度洗脫程序?qū)ψ貦八岷陀退岱蛛x的影響。梯度1：0～15min，65%A～80%A；梯度2：0～25m in，65%A～80%A。發(fā)現(xiàn)采用梯度1（圖1-c）時(shí)，兩種脂肪酸有分離趨勢但沒有達(dá)到基線分離；采用梯度2時(shí)，兩種脂肪酸達(dá)到基線分離。最終確定梯度2為脂肪酸色譜分離條件（圖1-d）。

2.1.2 流速對蠶蛹油中脂肪酸分離的影響 其他色譜條件不變的情況下，比較了流速0.6、0.8、1.0、1.2m L/m in時(shí)混合脂肪酸的色譜圖，結(jié)果表明，流速小于1.0m L/m in時(shí)，脂肪酸分離時(shí)間較長，響應(yīng)值也逐漸減小，但各脂肪酸分離效果沒有提高；當(dāng)流速大于1.0m L/min時(shí)，脂肪酸分離時(shí)間短，響應(yīng)值和相對分離效果不變。確定最終流速為1.0m L/m in。

2.1.3 柱溫對蠶蛹油中脂肪酸分離的影響 其他色譜條件不變的情況下，比較了柱溫30、40、50℃時(shí)的分離情況，結(jié)果見圖2，發(fā)現(xiàn)柱溫升高，脂肪酸的分析時(shí)間提前，響應(yīng)值增加，但基線噪音也同時(shí)增大。當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，各脂肪酸峰形較好，響應(yīng)值也較高，因此固定柱溫為30℃。

圖2 不同柱溫下三種脂肪酸的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of different temperature for the separation of 3 fatty acids

2.1.4 乙酸含量對蠶蛹油中脂肪酸分離的影響 流動(dòng)相中加入乙酸能夠抑制羧基的質(zhì)子化，從而改善脂肪酸出峰晚、響應(yīng)值低、峰塌陷等問題[5，13]。本文比較了乙酸含量0.05%、1%、2%時(shí)的分離情況，結(jié)果見圖3，乙酸含量0.05%時(shí)，樣品的響應(yīng)值較小，乙酸含量2%時(shí)，各組分的響應(yīng)值較大，分離效果也較好，因此固定乙酸含量為2%。

通過以上研究，確定蠶蛹油主要脂肪酸定量分析色譜條件為：色譜柱：Hanbon C18柱（5μm，250mm× 4.6mm）；流動(dòng)相A：丙酮；流動(dòng)相B：水（2%乙酸）；洗脫程序：0～25m in，65%A～80%A；流速1.0m L/m in；ELSD檢測器。該條件下，各脂肪酸的保留時(shí)間范圍分別為：亞麻酸（20.8～21.6min）、棕櫚酸（27.6～28.4min）、油酸（28.5～29.3m in）。

圖3 不同乙酸含量下三種脂肪酸的液相色譜圖Fig.3 Chromatogram of different Acetic acid concentration for the separation of 3 fatty acids

2.2 蠶蛹油中脂肪酸定量分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在上述色譜條件下分別對三種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，對各組分峰面積及濃度取自然對數(shù)后線性回歸，繪制工作曲線，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍（見表1）。

表1 蠶蛹油中三種脂肪酸的線性方程及線性范圍Table1 Calibration curves and limits of detection for 3 fatty acids in pupa oil

由表1可知，本法所測三種脂肪酸的線性回歸方程的R2均＞0.99，線性關(guān)系良好，滿足脂肪酸樣品的定量測定。

2.2.2 方法精密度及加樣回收率測定 為檢測分析方法的重復(fù)性，三種脂肪酸分別選擇兩個(gè)濃度，平行進(jìn)樣6次，按實(shí)驗(yàn)方法1.2.3中色譜條件測定各脂肪酸含量，結(jié)果見表2。多次測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于2%，證明本方法的精密度較高。

用1.2.2方法配制一定濃度蠶蛹油水解后脂肪酸樣品，按表3所示添加脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)。通過計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表3。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Reproducibility（RSD%）of the 3 fatty acids using the HPLC-ELSDmethod

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Recovery of the 3 fatty acids using the HPLC-ELSDmethod

由表3可知，三種脂肪酸的加樣回收率在97%～107%之間，RSD在0.4%～2.0%之間，說明本方法可靠，測定準(zhǔn)確度較高。

2.3 對照實(shí)驗(yàn)

分別采用本方法和國標(biāo)方法GB/T 17377-2008對蠶蛹油中三種脂肪酸進(jìn)行測定，每種方法測定3次，結(jié)果見表4。

經(jīng)F檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)，方法的檢測結(jié)果無顯著性差異。本方法與傳統(tǒng)國標(biāo)法[14]相比，樣品處理過程簡化，進(jìn)樣前無需甲酯化，定量分析時(shí)不需要校正因子和內(nèi)標(biāo)物，一定程度上提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本方法與國標(biāo)規(guī)定的方法對蠶蛹油中脂肪酸的檢測結(jié)果基本一致，可用本方法代替國標(biāo)法對蠶蛹油總脂肪酸進(jìn)行分析檢測。

3 結(jié)論

本文建立了一種檢測蠶蛹油中三種主要脂肪酸的HPLC-ELSD方法。以丙酮-水（2%乙酸）（v∶v）為流動(dòng)相，梯度洗脫，亞麻酸、棕櫚酸和油酸實(shí)現(xiàn)基線分離，三種脂肪酸的線性范圍分別為0.2～2.0mg/m L、0.1～2.0mg/m L，0.2～2.5mg/m L，線性關(guān)系良好，回收率為97%～107%，RSD均＜2%，該方法重復(fù)性好，適用于蠶蛹油中主要脂肪酸的分析檢測。

表4 兩種方法測定結(jié)果比較Table4 Comparison of themeasurement results of the twomethods

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