支氣管哮喘患兒痰液Eos比例、MMP-9水平變化及意義

鄧莉莉，何 驍，彭艷輝

(1郴州市第一人民醫(yī)院北院，湖南郴州423000;2郴州市第一人民醫(yī)院中心醫(yī)院; 3南華大學附屬第一醫(yī)院)

支氣管哮喘是一種氣道炎癥性疾病，炎性細胞、細胞因子在哮喘發(fā)病中的作用是近年哮喘病研究的熱點。2010年10月～2011年10月，我們對40例支氣管哮喘患兒痰液嗜酸性粒細胞(Eos)比例、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)進行了測定，旨在探討支氣管哮喘患兒不同病程誘導痰液中上述指標的變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院收治的輕度支氣管哮喘患兒40例(觀察組)，男20例，女20例;年齡6～10歲。均符合兒童支氣管哮喘診斷標準［1］。排除標準:①除哮喘之外的喘息性疾病及其他呼吸系統(tǒng)相關性疾病(如支氣管肺發(fā)育不良、支氣管異物、胃食管返流等);②合并嚴重心肝腎等內臟疾病、免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、傳染性疾病、寄生蟲疾病、皮膚病;③發(fā)病前2個月內曾經應用糖皮質激素及非糖皮質激素類抗炎藥如色甘酸鈉、白三烯調節(jié)劑、抗組胺抗過敏藥物等;④不能耐受高滲鹽水霧化或經高滲鹽水霧化30 min后仍無痰的小兒或重度喘息發(fā)作者。另選同期健康體檢兒童40例(對照組)，男21例，女19例;年齡5～9歲。兩組一般資料無統(tǒng)計學差異。

1.2 痰液Eos計數(shù)及MMP-9檢測方法

1.2.1 痰液誘導 參照歐洲呼吸協(xié)會誘導痰液指導小組的指南［2］并加以改進。對照組、觀察組急性期(入院24 h內)及臨床緩解期(臨床癥狀停止及哮鳴音消失后5 d)進行誘導痰，具體方法如下:受試者清潔口鼻后吸入200μg沙丁胺醇，用醫(yī)用面罩式超聲霧化器，直接吸入 3%高滲鹽水，流量為1 L/min，誘導20～30 min，誘導過程中隨時將痰咳出，不易咳出者則由專職護師按正規(guī)操作吸痰，將痰置于干凈、無菌的帶刻度容器中。同時嚴密觀察小兒的呼吸頻率、氣喘等情況，如不能耐受或吸入高滲鹽水后30 min仍無痰液導出則立即停止操作。收集的痰液在1 h內處理，處理前4℃冰箱保存。

1.2.2 痰液處理 ①選取合格痰液。挑取含黏液的痰栓，顯微鏡下觀察鱗狀上皮細胞小于5%并可見肺巨噬細胞時認為是合格［3］。②將痰液稱重，加入4倍痰量0.1%的二硫蘇糖醇，在旋渦式混合器上混勻。③置于37℃恒溫水育箱孵育15 min。④加4倍痰量磷酸鹽緩沖液(PBS)后繼續(xù)水浴5 min。⑤將稀化的痰液經48μm尼龍膜過濾后，離心機2 000 r/min離心10 min，收集上清液，-70℃冰箱保存待測;細胞成分重懸于PBS中，涂片2張，編號。

1.2.3 痰細胞染色 將涂片自然干燥后置于二甲苯內2 min。再移至無水乙醇內2 min，取出排液后移至90%乙醇內1 min。再移至蘇木素染液內靜置30 min，然后置入沖洗盆內沖洗10 min，使粉紅色變?yōu)樗{色。涂片在鹽酸乙醇內浸漬伴搖動數(shù)秒，再次沖洗使涂片再次變藍。將涂片移到1%伊紅液內2 min，對比染色，再沖洗涂片3 min，分化伊紅。取出排液后移到90%乙醇內搖振15 s，再移至無水乙醇Ⅰ內搖振15 s，再移至無水乙醇Ⅱ內搖振30 s。涂片移至二甲苯Ⅰ內15 s，再移至二甲苯Ⅱ內15 s，取出后封固。

1.2.4 Eos計數(shù) 由不知道患者病情的病理醫(yī)師在高倍顯微鏡下計數(shù)400個有核細胞(包括Eos、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞)，計算Eos比例。

1.2.5 MMP-9檢測 采用ELISA法檢測兩組痰上清液MMP-9。試劑盒由美國R＆D Systems公司提供，嚴格按說明書步驟操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。所得數(shù)據(jù)以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較則采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩變量之間相關性檢驗則采用直線相關分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組痰液中Eos比例、MMP-9水平比較，見表1。觀察組急性發(fā)作期、臨床緩解期MMP-9水平與Eos比例均呈正相關(r分別為0.89、0.92，P均＜0.01)。

表1 兩組痰液中Eos比例、MMP-9水平比較(±s)

表1 兩組痰液中Eos比例、MMP-9水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與同組臨床緩解期比較，△P＜0.01

組別 Eos(%) MMP-9(ng/mL)觀察組急性發(fā)作期 15.50±0.28＊△ 132.25±0.85＊△臨床緩解期 10.78±0.25* 101.80±5.32*對照組0.48±0.54 41.04±0.45

3 討論

支氣管哮喘是氣道炎癥性疾病，急性炎癥引起支氣管平滑肌收縮、血漿滲出等，從而導致喘息急性發(fā)作。支氣管哮喘也是慢性氣道炎癥，即在無癥狀的穩(wěn)定期氣道炎癥仍存在，以致喘息反復發(fā)作和氣道重塑。反復炎癥刺激可引起氣道重塑，其表現(xiàn)為氣道壁增厚、氣道平滑肌增生肥大及氣道壁細胞外基質(ECM)各成分的改變。誘導痰是以高滲鹽水霧化吸入誘導無痰或少痰受檢者產生足量痰液，以對下氣道分泌物中的細胞及其他液相成分進行分析研究的一種無創(chuàng)的檢測方法。作為一種直接的非侵入性定量定性檢測氣道炎癥的方法［4］，誘導痰安全、可靠［5］、簡便且患者易于接受，其具體優(yōu)點表現(xiàn)如下:①標本來源豐富，易濃縮和重復，且安全性高;②可提供與支氣管肺泡灌洗液相似的氣道炎癥的定量信息;③可直接檢出與炎癥反應相關的炎性細胞、炎性介質和細胞因子;④誘導痰液來源于外周氣道至中央氣道比來源于肺段氣道和肺泡的分泌物，更能反映氣道分泌物的自然狀態(tài)。

痰液細胞成分可進行細胞分類、免疫組化和分子生物學等檢查，而液相成分可用于分子成分的測定，因此可對哮喘患兒的痰液細胞成分進行分析，以研究氣道炎癥發(fā)生的可能機制。Gereng等［6］發(fā)現(xiàn)，哮喘患者誘導痰中Eos的形態(tài)和功能與血液檢測結果一致，Eos是臨床上反映氣道炎癥的重要標志。本研究顯示，觀察組急性發(fā)作期Eos比例明顯高于臨床緩解期及對照組，說明Eos參與哮喘的發(fā)病，這與Louis等［7］研究結果一致;本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組臨床緩解期Eos比例亦高于對照組，提示喘息停止后氣道炎癥和氣道高反應仍可以長期存在。因此，本研究為哮喘病長期規(guī)范治療的必要性提供了一定的理論基礎，即哮喘病診斷一旦成立，不論輕重，都需要進行及時且持續(xù)地抗炎治療。

基質金屬蛋白酶家族是由20多種高度保守的鋅、鈣離子依賴性蛋白內切酶所組成，可降解細胞外基質的大多數(shù)蛋白。在MMPs中，MMP-9與哮喘的關系最密切［8，9］。MMP-9的增加，可導致氣道損傷，促進炎性細胞到達間質和氣道壁，刺激、激活基質的生長因子，促進血管生成、成纖維細胞增生和分解呼吸道和肺內的結構復合物ECM和基底膜，因此參與呼吸道和肺的重建［10，11］。本研究顯示，觀察組急性發(fā)作期MMP-9水平明顯高于臨床緩解期及對照組，可知MMP-9水平升高是反映喘息急性發(fā)作及氣道炎癥變化較為客觀的指標，此與Belleguic等［12］研究一致;本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組臨床緩解期MMP-9水平亦高于對照組，說明MMP-9作為氣道炎癥標志物，與喘息發(fā)作頻率和發(fā)作的時間長短有關。同時亦提示不管是喘息正在發(fā)作，還是喘息停止，氣道炎癥依然持續(xù)存在。

在炎癥狀態(tài)下，炎性細胞和結構細胞表達MMP-9明顯增強［13］。MMP-9降解時，其在內皮和上皮細胞基底膜上打孔，從而促使炎性細胞游出和聚集于靶器官。降解的片斷具有趨化作用，可促進炎癥反應的加重;氣道的炎癥可以引起氣道的損傷，進而引起氣道的修復和重塑。本結果顯示，觀察組急性發(fā)作期、臨床緩解期MMP-9水平與Eos比例均呈正相關，說明兩者共同參與了喘息發(fā)作的病理生理過程。ECM重建是哮喘發(fā)病的重要特征，在TNF-α刺激下，其主要效應細胞Eos的MMP-9轉錄水平顯著增高。該現(xiàn)象可被NF-κB抑制劑和蛋白激酶C抑制因子所抑制，說明Eos受到炎性介質刺激后可大量合成MMP-9，參與氣道的改建。同時活化的MMP-9又促進Eos穿越基底膜向炎性反應部位浸潤，從而形成惡性循環(huán)。但MMP-9水平與Eos比例不是完全相關，這一點也提示氣道炎癥的改變并非僅由氣道局部浸潤的Eos決定，也許還存在其他因素的參與，具體機制尚需進一步研究。

總之，誘導痰炎性細胞尤其是Eos及細胞因子MMP-9與哮喘患兒氣道病變的關系密切，兩者能較好反映哮喘氣道炎癥狀況，其有望成為無創(chuàng)觀察哮喘病情變化的新指標。

［1］中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組.兒童支氣管哮喘防治常規(guī)［J］.中華兒科雜志，2008，46(10):745-753.

［2］Efthimiadis A，Spanevello A，Hamid Q，et al.Methods of sputum processing for cell counts，immunocytochemistry and in situhybridization［J］.Eur Respir J，2002，37(Suppl):19-23.

［3］Pizzichini E，Pizzichini MMM，Efthimiadis A，et al.Indices of airway inflammation in induced sputum:reproducibility and validity of cell and fluidphasemeasurements［J］.Am JRespir Crit Care Med，1996，154(2):308.

［4］Louis R，Potmans V.Analysis of induced sputum in refractory asthma［J］.Presse Med，2008，37(1 Pt2):155-159.

［5］Spanevello A，Migliori GB，Sharara A，et al.Induced sputum to assess airway inflammation:a study of reproducibility［J］.Clin Exp Allergy，1997，27(10):1138-1144.

［6］Gereng EA，Sukhodolo IV，Pleshko RI，et al.Comparative study of eosinophils in the blood and induced sputum during bronchial asthma［J］.Bull Exp Biol Med，2004，137(1):50-52.

［7］Louis R，Lau LC，Bron AO，et al.The relationship between airways inflammation and asthma severity［J］.Am JRespir Crit Care Med，2000，161(1):9-16.

［8］Bergeron C，Boulet LP.Structural changes in airway diseases: characteristics，mechanisms，consequences，and pharmacologic modulation［J］.Chest，2006，129(4):1068-1087.

［9］Ohbayashi H，Shimokata K.Matrixmetalloproteinase-9 and airway remodeling in asthma［J］.Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2005，4(2):177-181.

［10］Suzuki R，Miyazaki Y，Takagi K.Matrixmetalloproteinases in the pathogenesis of asthma and COPD:implications for therapy［J］.Treat Respir Med，2004，3(1):17-27.

［11］Prause O，Bozinovski S，Anderson GP，et al.Increased matrix metalloproteinase-9 concentration and activity after stimulation with interleukin-17 in mouse airways［J］.Thorax，2004，59(4):313-317.

［12］Belleguic C，CorbelM，Germain N，etal.Increased release ofmatrixmetalloproteinase-9 in the plasma of acute severe asthmatic patients［J］.Clin Exp Allergy，2002，32(2):217.

［13］Mercer PF，Shute JK，Bhowmik A，et al.MMP-9，TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patientsduring exacerbation［J］.Respiratory Res，2005，22(6):151.