GTPs對PD小鼠脊髓前角星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化的影響及機(jī)制探討

葉 俊，磨潔琳，陳 敏

(1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林541001;2廣西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室; 3桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室)

帕金森病(PD)是一種常見于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病率隨年齡的增加而增高，其病理改變主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的漸近性丟失及壞死，臨床上出現(xiàn)肌強(qiáng)直、肢體震顫和運(yùn)動減少等癥狀［1］。目前，大量致病機(jī)制假說涉及環(huán)境毒素、氧化應(yīng)激、線粒體功能破壞、興奮性氨基酸毒性、鈣離子失衡、膠質(zhì)細(xì)胞過度活化、自身免疫、細(xì)胞凋亡等，最終導(dǎo)致PD的發(fā)生、發(fā)展［2］。其中，氧化應(yīng)激學(xué)說得到了廣泛認(rèn)可。2012年12月～2013年6月，我們觀察了綠茶多酚(GTPs)對PD小鼠脊髓前角星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 雄性SPF級C57BL/6J小鼠45只，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供;飼養(yǎng)條件:桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)室。自由攝食、飲水，待適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。MPTP［3］、小鼠抗大鼠膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP，Sigma公司);GTPs(浙江東方茶業(yè)科技有限公司)，純度100%，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量為70.75%;超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成公司);其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 動物分組及模型制備 45只小鼠隨機(jī)分為3組各15只。模型組以MPTP腹腔注射，7 d，30 mg/ (kg·d);預(yù)防組同以上述劑量注射MPTP，但制備模型前3個月開始GTPs干預(yù)［小鼠飲水中摻入GTPs，濃度為0.1%(W/V)］至注射MPTP結(jié)束;正常組連續(xù)7 d腹腔注射與MPTP同體積的生理鹽水，飲水中未加入GTPs。制模成功標(biāo)準(zhǔn):在注射MPTP 5～10 min內(nèi)出現(xiàn)躁動不安、立毛、豎尾、細(xì)小震顫，尤以下頜點(diǎn)頭狀震顫多見。而后活動減少，常蜷縮聚臥成團(tuán)，爬行蹣跚常見后肢托曳。上述急性中毒反應(yīng)于給藥3 h后逐漸減弱，12 h后基本消失，但小鼠活動仍減少。

1.3 GFAP陽性細(xì)胞變化觀察 末次注射藥物或生理鹽水次日處死動物取得樣品標(biāo)本。用1%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，灌注4%多聚甲醛固定(0.1 mol/L PB液配制pH值7.4)，取頸膨大(頸Ⅲ～胸Ⅱ)和腰膨大(胸Ⅻ～腰Ⅲ)，后固定4 h(4℃)，梯度蔗糖溶液(0.1 mol/L PB液配制pH值7.4)相繼下沉后橫斷連續(xù)冰凍切片，片厚40μm，隔三取一。切片經(jīng)0.01 mol/L PBS(pH值7.4)漂洗后以3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶;正常山羊血清室溫封閉;小鼠抗大鼠GFAP(1∶1 000)4℃過夜，生物素結(jié)合IgG (1∶200)、鏈菌素抗生物素—過氧化酶(1∶200)相繼室溫孵育2 h。ABC法染色。切片風(fēng)干，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照實(shí)驗(yàn)除以PBS代替GFAP外，其余步驟與上述相同，反應(yīng)結(jié)果為陰性。光鏡下觀察脊髓GFAP陽性細(xì)胞變化。

1.4 GFAP陽性細(xì)胞計數(shù) 每只動物選擇3張頸、腰膨大切片，觀察脊髓前角，計數(shù)GFAP陽性細(xì)胞(放大倍數(shù)10×40)，分析系統(tǒng)對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量測定。

1.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞變化觀察 各組中隨機(jī)挑選2只動物，腹腔注射1%水合氯醛(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，經(jīng)心灌注4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合液200 mL。取頸膨大和腰骶膨大脊髓前角，切成1 mm3的小塊，送電鏡室制做超薄切片，醋酸鈾—枸櫞酸鉛染色。電鏡下觀察各組脊髓前角星形膠質(zhì)細(xì)胞變化。

1.6 SOD、MDA檢測 各組動物分別處理結(jié)束后5 d各取8只小鼠，小鼠迅速斷頭取脊髓頸膨大和腰骶膨大，冰上快速分離前角組織，吸干稱重后充分勻漿，離心30 min(14 000 r/min，4℃)。參照試劑盒說明書檢測SOD和MDA水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采取SPSS17.0統(tǒng)計軟件。應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行處理，根據(jù)方差齊性與否選擇相應(yīng)的檢驗(yàn)方法，即方差齊的資料用LSD法檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，方差不齊的資料兩兩比較用Games-Howell法檢測。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組GFAP陽性細(xì)胞變化 結(jié)果見圖1。由圖1可知，各組GFAP陽性細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。

圖1 各組GFAP陽性細(xì)胞(標(biāo)尺示25μm)

2.2 各組GFAP陽性細(xì)胞計數(shù) 結(jié)果見表1。

表1 各組GFAP陽性細(xì)胞計數(shù)(個/視野，±s)

表1 各組GFAP陽性細(xì)胞計數(shù)(個/視野，±s)

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別GFAP陽性細(xì)胞頸膨大 腰膨大模型組 12.36±2.75* 13.21±3.22*預(yù)防組 9.28±1.90# 9.87±1.88#正常組6.68±1.91 7.98±1.67

2.3 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞變化 模型組出現(xiàn)較多活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，增生、肥大，常成群分布，細(xì)胞胞體、胞核增大，胞質(zhì)豐富，其內(nèi)細(xì)胞器增多;正常組與預(yù)防組活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞較少。

2.4 各組SOD、MDA水平比較 結(jié)果見表2。

3 討論

以往有關(guān)PD的研究通常聚焦于中腦黑質(zhì)及紋狀體，對于同為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓探究甚少。脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)組成部分，尤其是在運(yùn)動的發(fā)起、執(zhí)行和控制等，脊髓前角的病變在本課題組之前的研究中已涉及，并且以GTPs預(yù)防性干預(yù)能緩解多巴胺能神經(jīng)元的損傷，但GTPs是否能緩解星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化卻鮮見報道［4，5］。神經(jīng)元是人腦基本的構(gòu)成單位，被膠質(zhì)細(xì)胞緊緊包圍，膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量比神經(jīng)元多出10～50倍，且占據(jù)了腦體積的一半。而在所有的膠質(zhì)細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多，其異常激活是PD黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性、缺失及進(jìn)行性變性級聯(lián)放大的重要原因［6～8］。中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的漸近性丟失及壞死，路易氏體(LB)的形成是PD的特征性病理變化，但是目前研究傾向認(rèn)為黑質(zhì)既不是首先更不是惟一受累的部位。越來越多證據(jù)證明，在胃腸道、唾液腺、迷走神經(jīng)背核都有LB的形成，提示PD病變部位更加廣泛，并不局限于黑質(zhì)和紋狀體，涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他部分，甚至是全身性疾病，本研究結(jié)果與此是一致的。

表2 各組SOD、MDA水平比較(±s)

表2 各組SOD、MDA水平比較(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別SOD(U/mg)頸膨大 腰膨大MDA(nmol/mg)頸膨大 腰膨大模型組 51.00±8.81* 54.00±7.91* 1.76±0.21* 1.67±0.19*預(yù)防組 68.00±6.85# 69.00±6.32# 1.36±0.28# 1.39±0.22#正常組79.00±5.08 81.00±6.12 0.92±0.27 0.87±0.12

中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見退行性疾病如老年性癡呆、PD、多發(fā)性硬化等，星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活能進(jìn)一步促進(jìn)上述退行性疾病的病理發(fā)生和進(jìn)程，其產(chǎn)生的大量致炎因子以及氧化應(yīng)激分子導(dǎo)致神經(jīng)元的二次損傷［9～11］;同時，神經(jīng)元的損傷又能刺激膠質(zhì)細(xì)胞的不斷激活，從而形成了病理過程的惡性循環(huán)［12］。星形膠質(zhì)細(xì)胞適度激活對能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，而迅速增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞將損傷部位快速隔離，形成一個相對局限封閉的環(huán)境，阻斷炎癥向周圍區(qū)域擴(kuò)散［13］;釋放眾多神經(jīng)保護(hù)因子如NGF、BDNF、GDNF，可保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受神經(jīng)毒素的侵襲。長期、大量的不良刺激誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，產(chǎn)生炎癥因子如IL-1、TNF-α、IL-10及干擾素誘導(dǎo)蛋白等損傷多巴胺能神經(jīng)元，成為PD持續(xù)進(jìn)展的病理因素之一。由于先天的缺陷或環(huán)境因素的作用，中腦黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞無法有效的清除在氧化過程中產(chǎn)生的某些細(xì)胞的毒物如自由基，導(dǎo)致其含量超過正常的范圍，進(jìn)而破壞脂類、蛋白和核酸等，由此產(chǎn)生的“氧化應(yīng)激”，會導(dǎo)致多巴胺能細(xì)胞死亡。

GTPs是一種抗氧化劑，是植物綠茶中所提取的富含兒茶素的多酚化合物。其內(nèi)大量含有的最有活性的EGCG，具有明確的抗氧化、清除自由基的積極作用［14，15］。近年來研究表明，EGCG在許多神經(jīng)變性疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用［16～18］。EGCG是GTPs的重要活性成分，主要以原型存在于血液和靶器官中，且能夠通過血腦屏障滲透進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，成為其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的前提［19］。GTPs是具有公認(rèn)的抗氧化及清除自由基作用［20］。本研究提示，GTPs能夠減輕MPTP模擬PD模型造成的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，降低SOD及提高M(jìn)DA水平和活性，增加抗氧化能力。

［1］Zhang ZX，Roman GC，Hong Z，etal.Parkinson's disease in China:prevalence in Beijing，Xi'an，and Shanghai［J］.Lancet，2005，365(9459):595-597.

［2］Yang YX，Wood NW，Latchman DS.Molecular basis of Parkinson's disease［J］.Neuroreport，2009，20(2):150-156.

［3］Langston JW，Ballard P，Tetrud JW，et al.Chronic parkinsonism in humans due to a product ofmepe-ridine analog synthesis［J］.Science，1983，219(4587):979-980.

［4］陳敏，勞明，韋獻(xiàn)良，等.MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠脊髓前角結(jié)構(gòu)變化的觀察［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32(13):1648-1651.

［5］陳敏，黃雪芳，葉俊，等.綠茶多酚對帕金森病小鼠多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(7):721-723.

［6］Temple S.The devel opment of neural stem cells［J］.Nature，2001，414(6859):112-117.

［7］Amor S，Puentes F，Baker D，etal.Inflammation inneurodegenerative diseases［J］.Immunology，2010，129(2):154-169.

［8］Chen PC，Vargas MR，Pani AK，et al.Nrf2-mediated neuroprotection in the MPTPmousemodel of Parkinson's disease:critical role for the astrocyte［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106 (8):2933-2938.

［9］Allan SM，Rothwell NJ.In flammation in centralnervous system injury［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2003，358(1438): 1669-1677.

［10］Akiyama H，Barger S，Barnum S，et al.Inflammation and alzheimer's disease［J］.Neurobiol Aging，2000，21(3):383-421.

［11］Zaheer S，Thangavel R，Wu Y，et al.Enhanced expression of glia maturation factor correlates with glial activation in the brain of triple transgenic alzheimer's disease mice［J］.Neurochem Res，2013，38(1):218-225.

［12］Craft JM，Watterson DM，Hirsch E，et al.Interleukin 1 receptor antagonist knockoutmice show enhanced microglial activation and neuronal damage induced by in tracerebroven tricular infusion of human amyloid［J］.JNeuroinflammation，2005，20(2):15.

［13］Kalla R，Liu ZQ，Xu S，etal.Microglia and the early phase of immune surveillance in the axotomized facialmotor nucleus:impaired microglial activation and lymphocyte recruitment but not effect on neuronal survival or axonal regeneration inmacrophage colony stimulating factor-deficientmice［J］.JComp Neurol，2001，436(2): 182-201.

［14］Nanjo F，Goto K，Seto R，etal.Scavenging effects of tea catechins and their derivatives on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical［J］.Free RadBiol Med，1996，21(6):895-902.

［15］Raut A，Ratk A.Oxidative damage and sensitivity to nociceptive stimulus and opioids in aging rats［J］.Neurobiol Aging，2009，30 (6):910-919.

［16］Chechoway H，Powers K，Smith-welle T，et al.Parkinson's disease risks associated with cigarette smoking，alcohol consumption，and caffeine intake［J］.Am J Epidemiol，2002，155(8):732-738.

［17］Levitesy，Weinreb O，Maor G，et al.Green tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate prevents N-methy-1-4-pheny-1-1，2，3，6-tetrahydropyridine-induced dopaminergic neurodegeneration［J］.JNeurochem，2001，78(5):1073-1082.

［18］Liu L，Yu LC.Potential protection of green tea polyphenols against ultraviolet irradiation-induced injury on rat cortical neurons［J］.Neurosci Lett，2008，444(3):236-239.

［19］Abdelmohsen MM，Kuhnle G，Rechnner AR，et al.Uptake and metabolism of epicatechin and its access to the brain after oral ingestion［J］.Free Radic Biol Med，2002，33(12):1693-1702.

［20］Ounjaijean S，Thephinlap C，Khansuwan U，et al.Effect of green tea on iron status and oxidative stress in iron-loaded rats［J］.Med Chem，2008，4(4):365-370.