麥芽蛋白與多酚相關(guān)指標對麥汁敏感蛋白和敏感多酚含量的影響

李天宇，董建軍，余俊紅，陸 健，劉 佳，胡淑敏，黃樹麗，黃淑霞，尹 花，孫軍勇

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122; 2.青島啤酒有限公司啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東青島266061; 3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122; 4.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122)

啤酒是一種穩(wěn)定性不強的膠體溶液，易受到外界條件及本身成分的影響，導(dǎo)致其膠體平衡狀態(tài)被破壞從而產(chǎn)生沉淀，使啤酒變混濁。而國家啤酒標準［1］將優(yōu)級淡色啤酒的濁度值規(guī)定為小于0.9EBC。

國內(nèi)外對啤酒膠體穩(wěn)定性進行了多年的研究，Bam forth［2］和Chapon等［3］指出造成啤酒混濁的主要物質(zhì)為敏感蛋白和敏感多酚，2mg/L含量敏感蛋白能造成啤酒1EBC濁度，王寶忠等［4］指出啤酒敏感蛋白含量同強化后啤酒濁度值具有強的正相關(guān)性。Asano［5］、Shewry［6］、Jones［7］和 Evens［8］等解釋了麥汁和啤酒敏感蛋白主要來自麥芽，敏感多酚主要來自麥芽與酒花［2］。兩者結(jié)合導(dǎo)致產(chǎn)生冷混濁以及永久性混濁［8］。Robinson等［9-10］從遺傳學(xué)角度分析了影響不同品種麥芽敏感蛋白含量的差異，指出缺少合成硅膠吸附蛋白(Silica Eluent，SE)的麥芽品種其釀造的啤酒混濁形成能力較低。Evans等［8］采用多克隆抗體的方法，建立了啤酒敏感蛋白與麥芽蛋白間的聯(lián)系。但是這些方法較復(fù)雜，不利于在實際生產(chǎn)中推廣。

由于敏感蛋白和敏感多酚在不同麥芽中含量差異較大，會對生產(chǎn)過程中的膠體穩(wěn)定性造成很大影響。因此從麥芽等原料源頭上預(yù)測其對麥汁、啤酒膠體穩(wěn)定性的影響，進而提前進行調(diào)控，對減少整個釀造過程膠體穩(wěn)定性的波動，具有重要現(xiàn)實意義。

現(xiàn)階段對于用麥芽相關(guān)指標評價膠體穩(wěn)定性的研究還未見報道，本文首先分析了不同麥芽麥汁敏感蛋白及敏感多酚含量差異，并研究了兩者同麥芽相關(guān)指標關(guān)系。其次，研究了不同麥芽的搭配比例對麥汁敏感蛋白和敏感多酚的影響，以期從膠體穩(wěn)定性的角度，提出原料搭配的原則。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥芽 澳大利亞麥芽 Gairdner、Baudin及Vlamingh，加 拿 大 麥 芽 Metcalfe、Copeland、及PolarStar，國產(chǎn)麥芽墾七;酒花 青島大花;大米 江蘇英盛米業(yè)粳米;單寧酸、PVP吸附劑 Sigma公司; α-淀粉酶、Folin-Ciocalteu(FC)試劑、Na2CO3、沒食子酸、溴甲酚綠、硼酸、硫酸銨、重鉻酸鉀 上海生物工程試劑公司;單寧酸溶液 取0.1000g單寧，用超純水定容至1L，充分混勻;PVP溶液 取0.4000g PVP，用超純水定容至1L，充分混勻。

高速離心機 美國 Sigma公司;LB-8糖化儀 德國Lochner公司;紫外分光光度計 美國GE公司;EBC粉碎儀 德國Buhler公司;單寧分析儀 德國Pfeuffer公司;濁度計 瑞典Sigrist公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥芽指標的測定 麥芽總酚的提?。?1］:使用EBC粉碎儀充分粉碎麥芽，稱取1g麥芽粉加入到10m L 80%(V/V)的丙酮中，超聲處理(40kHz，120W)1h后，10000×g離心10m in，上清即為麥芽總酚提取液。提取液于-20℃避光保存，在 24h內(nèi)使用。

麥芽總酚的測定采用FC法［12］:取0.5m L的樣品，加入到2.5m L的Folin-Ciocalteu試劑(10倍稀釋)中反應(yīng)5m in，隨后加入2m L 7.5%Na2CO3，并用去離子水定容至10m L。室溫保溫1h，在760nm波長下測定吸光值。

麥芽總氮、可溶性氮、庫爾巴哈值測定參照QBT 1686-2008［13］。

1.2.2 麥汁制備工藝 糖化工藝參考實際生產(chǎn)工藝，具體步驟如下。糊化:取粳米粉32g，依次加入0.075g CaSO4，100m L蒸餾水(60℃)，10μL淀粉酶。糖化:取 56.50g麥芽粉，依次加入 0.075g CaSO4，230m L蒸餾水(50℃)，15μL乳酸。采用的工藝曲線見圖1。糖化醪液用雙層濾紙過濾，并加入150m L保溫蒸餾水進行洗糟。在濾后麥汁中依次加入0.320g酒花，25μL乳酸，并在102℃煮沸60m in，煮沸結(jié)束后冷卻至室溫，使用雙層濾紙過濾，濾后麥汁用于下一步分析。

圖1 工藝曲線Fig.1 Craft curve

1.2.3 麥汁敏感蛋白及敏感多酚的測定 采用單寧分析儀測定［14］。

1.2.4 麥汁濁度的測定 采用濁度計進行測定。

1.2.5 麥芽搭配 不同品種麥芽粉碎后，將兩個品種的麥芽粉分別按重量比0∶10、1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1、10∶0搭配混勻，按照1.2.1糖化制備麥汁。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽指標與麥汁敏感蛋白、敏感多酚的關(guān)系

2.1.1 麥芽相關(guān)指標分析 為研究麥芽指標與麥汁敏感蛋白和敏感多酚的關(guān)系，選擇加麥(Copeland、Metcalfe、PolarStar)、澳 麥 (Gairdner、Baudin、V lam ingh)及國麥墾七等7個品種的麥芽共30個樣品按1.2.2糖化工藝制備麥汁，并分析麥芽自身指標與麥汁敏感蛋白和敏感多酚含量的關(guān)系。選擇與蛋白和多酚相關(guān)的麥芽指標:總氮、總酚、可溶氮及庫值進行了分析?？偟呛饬葵溠康鞍缀康闹匾笜?，其差異會對麥汁中蛋白含量造成影響，如表1所示，30個麥芽樣品中總氮含量分布范圍為1.36～1.93g/100g，其中澳麥Gairdner、Baudin的總氮含量要低于加麥Metcalfe、Copeland中的含量，這表明不同產(chǎn)區(qū)的不同麥芽品種其氮含量會有一定差異，而這可能與產(chǎn)區(qū)氣候以及不同品種的遺傳信息差異有關(guān)?？偡幼鳛樵u價麥芽多酚含量的重要指標，其含量差異對麥汁多酚含量具有重要影響，30個麥芽樣品總酚含量分布范圍為2.30～3.11mg/g。麥芽蛋白的溶解程度對麥汁中氮的含量具有重要影響，因此可溶性氮及庫值與麥汁氮含量緊密相關(guān)，30個麥芽樣品可溶性氮含量分布范圍為0.63～0.88g/100g，庫值分布范圍為39%～49%，由于兩者的含量受大麥品種及制麥工藝的影響較大，因此不同麥芽樣品間表現(xiàn)出了較大的差異。30個麥芽樣品的四個指標差異顯著，說明不同品種間大麥及不同工藝制得的麥芽，其蛋白和多酚含量確實差異顯著。這種顯著性的差異可能是由于大麥自身遺傳信息的差異或制麥過程中蛋白酶以及酚類酶活性的不同造成的［7，15-16］。

表1 麥芽相關(guān)指標含量Table1 The content of related indexes ofmalts

2.1.2 麥汁敏感蛋白和敏感多酚含量分析 采用1.2.2糖化工藝制備麥汁，分析麥汁的敏感蛋白及敏感多酚含量差異。結(jié)果如表2所示，麥汁敏感蛋白含量分布范圍為7.79～14.16EBC，敏感多酚分布范圍為23.2～57.5mg PVP/L，麥汁起始濁度值分布范圍為0.60～5.41EBC。其中澳麥Gairdner及Baudin敏感蛋白含量明顯低于加麥Metcalfe，而澳麥Gairdner的敏感多酚含量明顯處于較高水平，麥芽品種間的差異可能跟不同品種大麥自身遺傳信息不同有關(guān)，缺少合成硅膠吸附蛋白(SE)的品種其敏感蛋白的含量較低［9-10］。同一品種不同批次麥芽所制備的麥汁其敏感蛋白和敏感多酚含量也存在差異。這可能與大麥的收獲季節(jié)、產(chǎn)地、儲藏時間［16］以及不同麥芽廠使用的制麥工藝不同有關(guān)［17］，研究中選用的一些麥芽樣品分別來自于春季和秋季的大麥樣品，由不同麥芽生產(chǎn)廠提供(如澳麥Gairdner和加麥Metcalfe)。這些差異均能反映到麥芽相關(guān)指標上。

表2 不同麥芽麥汁樣敏感蛋白與敏感多酚的含量Table2 Content of sensitive protein and sensitive polyphenol in differentworts

2.1.3 麥汁敏感蛋白、敏感多酚同麥芽指標的關(guān)系 將麥汁敏感蛋白和敏感多酚與麥芽指標進行相關(guān)性分析。結(jié)果如表3，麥汁敏感蛋白與麥芽總氮(r=688，p＜0.01)、可溶性氮(r=0.686，p＜0.01)存在顯著正相關(guān)。這可能是由于敏感蛋白是麥芽中醇溶性儲藏蛋白溶解產(chǎn)生的［18］，而蛋白的溶解程度與麥芽的可溶性氮相互關(guān)聯(lián)，從而決定了麥汁敏感蛋白與麥芽可溶性氮呈現(xiàn)相關(guān)性。另外，由于麥汁中敏感蛋白主要由麥芽蛋白的溶解產(chǎn)生，可溶性蛋白或多肽，因此麥芽可溶性氮更能特定反應(yīng)麥汁敏感蛋白含量。進一步的數(shù)據(jù)分析表明，當(dāng)可溶性氮含量低于0.70g/100g左右時，其對應(yīng)的麥汁敏感蛋白含量低于9EBC。比較麥汁敏感多酚含量與麥芽總酚含量間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，麥汁敏感多酚含量與麥芽總酚具有較強相關(guān)性(r=0.646，p＜0.01)。敏感多酚主要來源于麥芽和酒花，其中70%的麥芽多酚都在麥汁中保留下來，而酒花的添加量較少，且大部分浸出的敏感多酚在煮沸過程被除去［2］，所以麥汁敏感多酚含量與麥芽多酚表現(xiàn)為典型正相關(guān)性。但麥汁中敏感蛋白與敏感多酚的含量與麥汁的初始濁度值并沒有表現(xiàn)出較強的相關(guān)性，這可能是由于麥汁濁度是多種物質(zhì)含量綜合作用的結(jié)果，麥汁濁度不僅與麥汁中敏感蛋白、敏感多酚含量相關(guān)而且與麥汁中大分子的多糖、糊精等相關(guān)，并且麥汁的糖組分含量以及粘度值遠大于啤酒，這都會對麥汁濁度造成影響。另外，敏感蛋白與敏感多酚作為潛在的形成混濁的物質(zhì)與麥汁的初始濁度值也可能沒有存在必然的聯(lián)系。

表3 麥芽和麥汁各指標間的相關(guān)性分析Table3 The correlationship between indexes ofmalts and itswort

綜上可知，麥芽可溶性氮及總酚指標可以初步評價麥汁敏感蛋白、敏感多酚的含量，為從原料的角度控制膠體穩(wěn)定性的研究提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。

2.2 麥芽搭配比例對麥汁敏感蛋白和敏感多酚含量的影響

選擇可溶性氮、總酚差異較大的加麥Metcalfe、澳麥Gairdner和國麥墾七(如表4)，將麥芽Metcalfe分別與澳麥Gairdner、國麥墾七按照不同比例搭配采用1.2.2麥汁制備工藝制備相應(yīng)的麥汁。

表4 實驗麥芽指標Table4 Themalt index used formalt blending

圖2 不同麥芽搭配比例對麥汁敏感蛋白和敏感多酚含量的影響Fig.2 Effect ofmalt blending on content of sensitive protein and sensitive polyphenol ofwort

分析搭配后制備麥汁的敏感蛋白發(fā)現(xiàn)，麥汁敏感蛋白的理論預(yù)測值與實際值符合的很好，說明麥芽搭配時，不同品種的麥芽的蛋白溶解沒有表現(xiàn)出協(xié)同或拮抗作用。因此在實際生產(chǎn)中，當(dāng)預(yù)測到麥汁的敏感蛋白過高時，可以通過搭配可溶性氮含量較低的麥芽來調(diào)控麥汁的敏感蛋白。

敏感多酚的結(jié)果如圖2(C和D)，將加麥Metcalfe與澳麥Gairdner麥芽搭配時發(fā)現(xiàn)，除搭配比例為90%(加麥Metcalfe∶澳麥Gairdner=9∶1)以外，其它比例下的搭配實際值均與預(yù)測值符合的較好。加麥Metcalfe和國麥墾七搭配時，除在比例50%(加麥Metcalfe∶國麥墾七=5∶5)時實際值低于預(yù)測值，其它比例搭配時實際值也均與預(yù)測值相符。這表明敏感多酚受到的影響因素較為復(fù)雜，一方面由于敏感多酚易受外界氧、pH的影響［19］，會造成含量上的波動;另一方面敏感多酚是一類易被氧化的中低聚體原花青素，占總酚的含量較低(僅占總酚3.3%)［19］，在煮沸過程中大量與蛋白結(jié)合形成沉淀，沉淀量與酚的氧化水平緊密相關(guān)［20］，這都會造成其含量上的波動。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)在相同的糖化工藝下，不同麥芽制備麥汁的敏感蛋白和敏感多酚同麥芽自身的可溶性氮和總酚密切相關(guān)，可以用這兩個指標初步評價或預(yù)測麥汁敏感蛋白及敏感多酚的含量。進而可以有針對性的選擇麥芽樣品用于麥汁制備，來保證麥汁中敏感蛋白及敏感多酚含量處于合理水平。另外，當(dāng)生產(chǎn)使用的麥芽中可溶性氮和總酚含量較高時，也可有針對性選擇的兩者含量較低的麥芽按照質(zhì)量比例搭配制備麥汁，進而來保證麥汁中的敏感蛋白與敏感多酚處于合理水平。

啤酒的膠體穩(wěn)定性研究是一個復(fù)雜而長期的過程，之前的研究重點集中于成品啤酒和下游處理工藝的研究。對于原料同麥汁和啤酒的膠體穩(wěn)定性的對應(yīng)關(guān)系研究相對較少。但影響膠體穩(wěn)定性的主要因素敏感蛋白、敏感多酚主要來源于原料麥芽，從源頭的控制尤為重要。

［1］郭新光，張五九，方貴權(quán)，等.GB4927-2008啤酒［S］.北京:中國標準出版社，2009

［2］Bamforth CW.Beer haze［J］.Journal of the American Society of Brewing Chemists，1999，57:81-90.

［3］Chapon L.The mechanics of beer stabilization［J］.Brewers’Guaidian，1994，123:46-50

［4］王寶忠.啤酒非生物穩(wěn)定性控制體系的研究［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012

［5］Asano K.Characterization of haze-forming proteins of beer and their role in chill haze formation［J］.J Am Soc Brew Chem，1982，40:147-154.

［6］Shewry P R.Barley seed proteins［J］.American Society ofCereal Chemists，1993:131-197

［7］Jones B L，Budde A D.How various malt endoproteinase classes affect wort soluble protein levels［J］.Journal of Cereal Science，2005，41(1):95-106.

［8］Evans D E，Robinson L H，Sheehan M C，et al.Application of immunologicalmethods to differentiate between foam-positive and haze-active proteins originating from malt［J］.J Am Soc Brew Chem，2003，61(2):55-62.

［9］Doner L W，Becard G，Irwin P L.Binding of flavonoids by polyvinyl-polygyrrolidone［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993，41:753-757.

［10］Robinson L H，Juttner J，Milligan A，et al.The identification of a barley haze active protein that influences beer haze stability: Cloning and characterisation of the barley SE protein as a barley trypsin inhibitor of the chloroform/methanol type［J］.Journal of Cereal Science，2007，45(3):343-352.

［11］Zhao H F，F(xiàn)an W，Dong J J，et al.Evaluation of antioxidant activities and total phenolic contents of typical malting barley varieties［J］.Food Chemistry，2008，107(1):296-304.

［12］Singletion V L，Joseph A，Rossi J.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents［J］.Am JEnol Vitic，1965，16(3):144-158.

［13］張五九，康永璞，熊曉帆，等.QBT 1686-2008啤酒麥芽［S］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2008.

［14］Chapon L.Nephelometry as a method for studying the relations between polyphenols and protein［J］.J Inst brew，1993，99:49-56.

［15］孔維寶，樊偉，陸健，等.麥芽制造過程中酚類物質(zhì)及其相關(guān)酶類的變化［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26(5): 61-65.

［16］Qi J C，Chen J X，Wang J M，et al.Protein and hordein fraction content in barley seeds as affected by sowing date and their relations tomalting quality［J］.Journal of Zhejiang University Science，2005，6B(11):1069-1075.

［17］Moll M.Colloidal stability of beer.In:Brewing Science［M］.Academic Press，1987:1-327.

［18］Zhang G，Chen J，Wang J，et al.Cultivar and Environmental Effects on(1→3，1→4)-β-D-Glucan and Protein Content in Malting Barley［J］.Journal of Cereal Science，2001，34(3): 295-301.

［19］Osman A M.Barley and malt proteins and proteinases:III.A simple method for estimating the combined actions of malt proteinases and the extent of protein degradation during malting［J］.J Inst brew，2003，109(2):150-153.

［20］Mcmurrough I，Baert T.Identification of proanthocyanidins in beer and their direct measurement with a duel electrode electrochemical detector［J］.J Inst brew，1994，100:409-416.