羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響

胡玨 王鴻 呂慶華 鄭英 朱永堅(jiān) 鄭鳴之

·論著·

羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響

胡玨 王鴻 呂慶華 鄭英 朱永堅(jiān) 鄭鳴之★

目的觀察羥基喜樹堿（hydroxycamptothecin， HCPT）單獨(dú)及與甲氧胺（methoxyamine，MX）聯(lián)合用藥在抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤（SHG44）膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中是否具有協(xié)同作用，以期減少HCPT用量，降低毒副反應(yīng)，為HCPT聯(lián)合MX應(yīng)用于抗膠質(zhì)瘤治療提供理論支持。方法聯(lián)合運(yùn)用HCPT與堿基切除修復(fù)抑制劑MX，用MTT法、流式細(xì)胞等方法檢測(cè)聯(lián)合用藥的體外抑瘤效果及可能的機(jī)制。結(jié)果HCPT聯(lián)合甲氧胺能顯著抑制SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，隨著濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，其增殖抑制效應(yīng)也隨之增強(qiáng)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，HCPT聯(lián)合MX組凋亡細(xì)胞比例明顯增多，但與單獨(dú)HCPT用藥組比較未見明顯差異。結(jié)論HCPT聯(lián)合MX對(duì)SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著增殖抑制作用，且具有明顯劑量-時(shí)間依賴性。

羥基喜樹堿 甲氧胺 協(xié)同作用 MTT

神經(jīng)膠質(zhì)瘤（SHG44）是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，手術(shù)不易全切，且化療效果差。提高化療效果的重要途徑之一是尋找高效低毒的化療增敏劑［1～3］。羥基喜樹堿（hydroxycamptothecin， HCPT）是從珙桐科植物喜樹中提取分離的生物堿，通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（TopoI）來(lái)達(dá)到治療惡性腫瘤的目的［4］。多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)羥基喜樹堿可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但體內(nèi)試驗(yàn)和臨床效應(yīng)不明顯。甲氧胺（methoxyamine， MX）是堿基切除修復(fù)的小分子抑制劑。有報(bào)道甲氧胺可增強(qiáng)烷化劑和放療的抗腫瘤效果［5］。作者自2009年10月至2012年10月以（SHG44）為模型，探討羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 羥基喜樹堿注射液（貴州漢方制藥有限公司提供）；甲氧胺（Sigma公司，美國(guó)）；人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所；DEME高糖培養(yǎng)液（青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml，GIBCO公司產(chǎn)品）；細(xì)胞周期測(cè)定試劑盒、流式細(xì)胞儀（Bection Dikinson公司產(chǎn)品）；CO2培養(yǎng)箱（Forma公司產(chǎn)品）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo Labsystems公司產(chǎn)品）。新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品）；二甲基亞砜（DMSO，上海生物工程有限公司產(chǎn)品）；噻唑藍(lán)（MTT）。

1.2 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)；倒置顯微鏡；37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱；酶標(biāo)儀；流式細(xì)胞儀。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SHG44細(xì)胞株，在含有10 %胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2.2 分組與藥物作用 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后，分組：（1）羥基喜樹堿（HCPT）：6.25、25、50、100μg/ml。（2）甲氧胺（MX）：10、30、60、120mM。（3） 聯(lián)合用藥組（HCPT +MX）：合用比例1：1。制成細(xì)胞懸液，1×104/孔個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl。在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)1d。加入不同濃度藥物的培養(yǎng)基，對(duì)照組只加細(xì)胞培養(yǎng)液不加藥。每個(gè)劑量組均設(shè)3個(gè)平行孔，再入培養(yǎng)箱中于相同條件下孵育。

2.3 MTT比色分析 分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，棄去培養(yǎng)液，加入含10%MTT（5mg/ml）的無(wú)血清液DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3h后吸去上清液，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，使所形成的MTT結(jié)晶物溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm處測(cè)定每孔吸光度（A）值，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。用直線回歸方程計(jì)算藥物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的IC50值（腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)50 %時(shí)化療藥物濃度）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1-（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）］×100%

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 消化細(xì)胞制成懸液（2×105/ml），每孔加2ml培養(yǎng)于6孔板，24h后加入各處理因素，按設(shè)計(jì)條件繼續(xù)培養(yǎng)。收集上清液，0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，與上清液一起收集，水平離心機(jī)1000r/min離心8min，去上清液，用PBS洗1遍。70%乙醇固定，4℃過(guò)夜，離心去除乙醇，PBS清洗2次。加入100μLRNA酶（lmg/ml）37℃水浴30min，置冰上2min終止RNA酶消化。加入PI染液（150μl/ml）1m1，室溫避光30min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每次計(jì)數(shù)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。以PI熒光讀數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)細(xì)胞周期各期的細(xì)胞數(shù)目，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自至少3組平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間差異性比較采用SPSS10.0軟件進(jìn)行分析，以O(shè)ne-Way ANOVA進(jìn)行方差分析后，以Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞株增殖的抑制作用 10mM的甲氧胺與不同濃度的羥基喜樹堿合用，作用72 h后，顯著增強(qiáng)羥基喜樹堿對(duì)SHG 44細(xì)胞的抑制作用，羥基喜樹堿單用時(shí)，IC50值為0.31mM，與10mM的甲氧胺合用時(shí)，IC50值為0.093mM，羥基喜樹堿單用是合用的3.33倍。甲氧胺濃度升高時(shí)，其增強(qiáng)羥基喜樹堿抑制作用更明顯，與30mM甲氧胺合用時(shí)，IC50值為0.076mM，羥基喜樹堿單用是合用的4.08倍。與60mM、120mM甲氧胺合用時(shí)，IC50值分別為0.056mM、0.0047mM。結(jié)果見表1。圖1。

表1 羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞株增殖的抑制作用［（x±s）n=6］

圖1 羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞株增殖的抑制作用

3.2 羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞凋亡的影響 羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺組和單獨(dú)羥基喜樹堿組細(xì)胞于藥物作用48h和72h時(shí)出現(xiàn)了明顯的凋亡，而且其凋亡率明顯高于空白對(duì)照組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA倍體含量較空白對(duì)照組出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，即Ap峰（Fig2）。羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺組細(xì)胞在作用48h和72h時(shí)的凋亡率稍高于單獨(dú)羥基喜樹堿組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖2，見表2。

圖2 SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)注：A組為空白對(duì)照組；B組為單獨(dú)羥基喜樹堿組；C組為羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺組；羥基喜樹堿聯(lián)合甲氧胺組和單獨(dú)羥基喜樹堿組細(xì)胞于藥物作用48h和72h時(shí)DNA倍體含量較空白對(duì)照組出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰。

表2 三組SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的比較［（x±s）%］

4 討論

與細(xì)胞死亡相關(guān)的DNA損傷程度因不同藥物而異，對(duì)DNA損傷的監(jiān)測(cè)可通過(guò)藥物作用后細(xì)胞存活的情況來(lái)反映。由于抑制DNA堿基切除修復(fù)有可能協(xié)同增強(qiáng)化療藥的抗瘤活性［6］，在實(shí)驗(yàn)中，作者利用MTT試驗(yàn)，觀察BER抑制劑甲氧胺聯(lián)合羥基喜樹堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲氧胺與不同濃度羥基喜樹堿合用，作用72h后，能顯著增強(qiáng)羥基喜樹堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的抑制作用，且作用時(shí)間越長(zhǎng)，濃度越大，其抑制作用越強(qiáng)，具有時(shí)間-劑量依賴性。而流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，羥基喜樹堿單用或與甲氧胺聯(lián)用，細(xì)胞凋亡比例上升，表明甲氧胺能增強(qiáng)羥基喜樹堿對(duì)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞造成的DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是其能增強(qiáng)羥基喜樹堿抗腫瘤活性的機(jī)制之一。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoisomerase I，Topo I）是生物體內(nèi)廣泛存在的必需酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核過(guò)程，是細(xì)胞生存的必需酶［7］。多種腫瘤細(xì)胞Topo I的含量遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，是選擇性抗腫瘤藥物的理想作用靶點(diǎn)。喜樹堿（camptothecin，CPT）來(lái)源于我國(guó)特有的珙桐科植物喜樹（camptotheca acuminate）。1985年，Hsiang等揭示了喜樹堿抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I（TopoI）新的作用機(jī)制［8］，逐漸成為世界性研究熱點(diǎn)。喜樹堿類藥物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的直接原因是由于其S期細(xì)胞毒性，使細(xì)胞終止在G2期［9］。處于S期細(xì)胞DNA大量復(fù)制，與拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑遭遇形成DNA復(fù)合體機(jī)會(huì)增多，從而使DNA斷裂點(diǎn)增多導(dǎo)致對(duì)喜樹堿類藥物誘導(dǎo)的凋亡最為敏感，約比G1或G2期細(xì)胞敏感1000倍［10］。但是Topo I抑制劑單獨(dú)用藥療效欠佳，且易產(chǎn)生耐藥。由于Topo I抑制劑耐藥細(xì)胞株多不對(duì)其他化療藥產(chǎn)生交叉耐藥，故通過(guò)不同機(jī)制的化療藥物配伍，如與Topo II抑制劑、TAX、鉑類、烷基抗癌藥等聯(lián)合應(yīng)用可提高療效并避免或減少耐藥的產(chǎn)生［11］。

堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）途徑可以消除和替換烷化劑及內(nèi)源性自由基等活性化學(xué)物質(zhì)引起的局限性核苷酸殘基損傷。至少有25種不同的基因參與這一途徑。堿基切除修復(fù)可能是增強(qiáng)化療藥抗腫瘤效果的潛在治療靶點(diǎn)［12］。甲氧胺是一種堿基切除修復(fù)的小分子抑制劑［13］。Yan L［14］等的研究顯示體外和人腫瘤異種移植模型中甲氧胺均能增強(qiáng)替莫唑胺的細(xì)胞毒作用。Liu L［15］等為改進(jìn)患卵巢癌患者治療方法，通過(guò)BER抑制劑甲氧胺和N-methypurine DNA glycosylase（MPG）的過(guò)度表達(dá)操縱DNA堿基切除修復(fù)途徑，結(jié)果顯示替莫唑胺和甲氧胺聯(lián)合應(yīng)用對(duì)沒有較佳化療方法的患者是不錯(cuò)的選擇。迄今為止，尚無(wú)以DNA修復(fù)路徑為靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入臨床。因此，BER抑制劑甲氧胺與化療藥物聯(lián)用，可降低化療藥劑量，減少化療藥的毒副作用，同時(shí)克服其非特異性細(xì)胞毒作用，是極有前途的治療方案。本研究的結(jié)果證實(shí)：（1）甲氧胺對(duì)羥基喜樹堿治療膠質(zhì)瘤具有協(xié)同作用。（2）羥基喜樹堿與甲氧胺協(xié)同作用具有時(shí)間、劑量依賴效應(yīng)。（3）初步證明兩者協(xié)同效應(yīng)通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將集中在進(jìn)一步闡明作用的分子機(jī)制。

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ObjectiveTo improve the glioma suppression effect of hydroxycamptothecin （HCPT）and reduce its side-effects by changing its pharmaceutical delivery form. To clarify whether a synergetic effect exists between HCPT and methoxyamine （MX）on the inhibition of glioma cell proliferation and provide theoretical basis for the further usage of HCPT in the treatment of glioma.MethodsMTT and flow cytometry （FCM） were applied to determine the growth inhibition effect of using HCPT alone or in combination with MX on SHG4 cell line.ResultsDifferent concentrations of HCPT and MX were used alone or in combination and this combination usage showed a higer inhibition rate than using HCPT or MX alone. FCM results showed more cells were stopped at the G2 phase in the HCPT + MX group. However， the difference was not statistically signif cant between HCPT + MX group and HCPT group.ConclusionHCPT could inhibit the proliferation of SHG44 cell and the combination of MX could increase this inhibitory effect on SHG44， suggesting a synergistic effect between HCPT and MX.

Hydroxycamptothecin Methoxyamine Synergy MTT

浙江省自然基金項(xiàng)目（Y2091211）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2009B004）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009CA044，2007CA060）

310053 浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（胡玨 王鴻 鄭鳴之）

310000 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（呂慶華 朱永堅(jiān)）

310013 杭州 中國(guó)人民解放軍第117醫(yī)院（鄭英）

*通訊作者