奶山羊AGPAT6基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

常振華顏偉俊王韋華何成孟曉靜

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714000；2.渭南市畜牧技術(shù)推廣中心3.蒲城縣地方公路站）

奶山羊AGPAT6基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

常振華1顏偉俊1王韋華1何成2孟曉靜3

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714000；2.渭南市畜牧技術(shù)推廣中心3.蒲城縣地方公路站）

利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)549只西農(nóng)薩能和關(guān)中奶山羊群的AGPAT6基因遺傳多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀（體高、體長(zhǎng)和胸圍）的相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明AGPAT6基因存在4個(gè)SNPs多態(tài)：P1、P2、P4與P10位點(diǎn)分別位于5'UTR（g.152G>C）、內(nèi)含子2（g.8124G＞A）、外顯子4（g.9263C>G）和3'UTR（g.16436G>A）。經(jīng)關(guān)聯(lián)分析，P2、P4和P10三位點(diǎn)在西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊品種中都屬于中度多態(tài)，4個(gè)SNPs的不同基因型對(duì)兩個(gè)奶山羊品種的生長(zhǎng)性狀影響均不顯著（P>0.05）。

奶山羊；AGPAT6基因；多態(tài)性；生長(zhǎng)性狀；關(guān)聯(lián)分析

薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊是著名的乳用山羊品種，以體格高大、產(chǎn)奶量高、適應(yīng)性強(qiáng)和遺傳穩(wěn)定而著稱。AGPAT，即磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶，也叫做溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)[1]。AGPAT能催化甘油三酯sn-2位置的酯化[2,3]，而甘油三酯是乳脂和體脂的主要成分，它能催化溶血磷脂酸形成磷脂酸[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，AGPAT可能有8種異構(gòu)體,其中AGPAT6基因等多個(gè)基因的mRNA表達(dá)上調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)參與乳脂合成和分泌[5]。在國(guó)內(nèi)，昝林森等就AGPAT6基因?qū)Σ煌废档暮伤固鼓膛Ｈ橹屎湍坍a(chǎn)量有過(guò)研究[6]，但目前尚未有AGPAT6遺傳多樣性對(duì)生長(zhǎng)性狀(體高、體長(zhǎng)、胸圍）影響的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究采用PCR-RFLP技術(shù)分析了西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊群體AGPAT6基因遺傳多態(tài)性及其對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響，旨在為奶山羊的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)采用頸靜脈法采血分別采集西農(nóng)薩能奶山羊268份來(lái)自陜西省千陽(yáng)縣西農(nóng)薩能奶山羊種羊場(chǎng)（202只）和西北農(nóng)林科技大學(xué)種羊場(chǎng)（66只）；關(guān)中奶山羊血樣281份來(lái)自陜西省三原縣關(guān)中奶山羊種羊場(chǎng)，共計(jì)549份。每個(gè)個(gè)體采集10mL，加ACD抗凝劑帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷凍存?zhèn)溆茫煌瑫r(shí)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量并記錄了549頭奶山羊的體尺指標(biāo)，其中包括體長(zhǎng)(BL)、體高(BH)和胸圍(CC)。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取與AGPAT6基因引物。本實(shí)驗(yàn)參照Chen[7]的方法奶提取山羊的血樣基因組DNA。所用到的引物全部參照GeneBank中提供的牛的AGPAT6基因序列（NC_007328.3），用Primer premier5.0軟件自行設(shè)計(jì)，如表1所示。

表1 AGPAT6基因所用引物信息和退火溫度bp,℃

1.2.2AGPAT6基因PCR-RFLP反應(yīng)條件。以奶山羊的混合DNA池（每10個(gè)不同樣本混合成一個(gè)DNA池）做模板進(jìn)行基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系如下：Taq DNA聚合酶0.4 μL、10×PCR Buffer 2.7μL、dNTPs 2.0μL、上游引物（F）0.5μL、下游引物(R)0.5μL、DNA模板（10ng/μL）1.0μL和超純水17.9μL，總體積是25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)次數(shù)33，72℃延伸10min，4℃保存。利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)發(fā)現(xiàn)的SNPs進(jìn)行分型。PCR-RFLP技術(shù)的具體方法為：將10×Buffer緩沖液1.0 μL、PCR產(chǎn)物5.0 μL、超純水3.5μL、限制性內(nèi)切酶（10u/μL）0.5μL混合，合計(jì)10μL。根據(jù)限制性內(nèi)切酶說(shuō)明書中的反應(yīng)溫度水浴8h，用3%的瓊脂糖電泳、成像，然后進(jìn)行基因型分析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)突變位點(diǎn)的基因分型結(jié)果，對(duì)測(cè)得的基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)和群體雜合度等群體遺傳參數(shù)。SPSS16.0用來(lái)計(jì)算基因型和奶山羊經(jīng)濟(jì)性狀之間的關(guān)系，基因型與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析中用到的模型為：Y ij(性狀值)=μ (群體均值)+Ai(年齡的固定效應(yīng))+Gj(基因型的固定效應(yīng))+eij(隨機(jī)誤差)。

2 結(jié)果與分析

2.1奶山羊AGPAT6基因多態(tài)性

通過(guò)對(duì)549只西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊的AGPAT6基因全部外顯子和部分5'UTR和3'UTR進(jìn)行分析，經(jīng)DNA池測(cè)序發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn)（P1，P2，P4，P10）：分別為5'UTR（g.152G>C）、內(nèi)含子2（g.8124G>A）、外顯子4（g.9263C>G）（見圖1）和3'UTR（g.16436G>A），其中外顯子4處突變引起蘇氨酸的一個(gè)同義突變，而5'UTR、內(nèi)含子2和3'UTR不進(jìn)行編碼蛋白，未引起氨基酸突變。

圖1 AGPAT6基因P4基因座CG型測(cè)序結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用PCR-RFLP和測(cè)序的方法去檢測(cè)已發(fā)現(xiàn)的4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。利用限制性內(nèi)切酶KpnI（引入酶切位點(diǎn)）對(duì)P1位點(diǎn)（g.152 G>C）的PCR產(chǎn)物（175bp）進(jìn)行分型，結(jié)果在兩個(gè)奶山羊品種中都檢測(cè)到了GG型、GC型和CC型三種基因型。利用限制性內(nèi)切酶EcoRΙΙ對(duì)發(fā)現(xiàn)的P2位點(diǎn)(g.8124G> A)的PCR產(chǎn)物(372bp)進(jìn)行分型，結(jié)果在兩個(gè)奶山羊品種中都檢測(cè)到了GG型、GA型和AA型三種基因型。利用限制性內(nèi)切酶NcoΙ對(duì)發(fā)現(xiàn)的P4位點(diǎn)(g. 9263C>G)的PCR產(chǎn)物（241bp）進(jìn)行分型，在兩個(gè)奶山羊品種中都檢測(cè)到了CC型、CG型和GG型三種基因型。最后，利用限制性內(nèi)切酶BglΙ對(duì)P10位點(diǎn)（g.16436G>A）的PCR產(chǎn)物（336bp）進(jìn)行分型，在兩個(gè)奶山羊品種中都檢測(cè)到了GG型、GA型和AA型三種基因型。群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：P2、P4和P10三位點(diǎn)在西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊品種中多態(tài)信息含量都屬于中度多態(tài)（表2）。2.2奶山羊AGPAT6基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

表2 P1、P2、P4和P10多態(tài)信息含量

SNPs與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析表明：4個(gè)SNPs（P1、P2、P4（見表3）和P10）的不同基因型對(duì)兩個(gè)奶山羊品種的生長(zhǎng)性狀影響均不顯著（P>0.05）。

表3 薩能和關(guān)中奶山羊AGPAT6-P4基因座不同基因型與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析

3 討論與結(jié)論

AGPAT6在調(diào)節(jié)甘油三酯的合成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[8]。對(duì)人類的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)超表達(dá)AGPAT6酶可以增加細(xì)胞中溶血磷脂酸和磷脂酸水平[9]。在小鼠上的報(bào)道顯示，缺失AGPAT6基因的小鼠在泌乳期會(huì)出現(xiàn)乳腺導(dǎo)管和乳腺上皮細(xì)胞中乳脂肪滴的大小和數(shù)量都顯著下降[10]。因此，AGPAT6是影響產(chǎn)奶性狀的一個(gè)關(guān)鍵基因，而為了完善這個(gè)基因的功能，我們?cè)噲D探索這個(gè)基因與奶山羊的生長(zhǎng)性狀的關(guān)系。

本研究通過(guò)對(duì)549只西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶山羊的AGPAT6基因全部外顯子和部分5'UTR和3'UTR進(jìn)行分析，經(jīng)DNA池測(cè)序發(fā)現(xiàn)了4個(gè)突變位點(diǎn)（P1、P2、P4與P10），通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)P1、P2、P4和P10多態(tài)位點(diǎn)與兩個(gè)奶山羊品種的生長(zhǎng)性狀均不相關(guān)（P>0.05）。因此，雖然在西農(nóng)薩能和關(guān)中奶山羊品種中發(fā)現(xiàn)了AGPAT6基因的4個(gè)突變位點(diǎn)，但是它們對(duì)這兩個(gè)品種的生長(zhǎng)性狀影響均不顯著，這一結(jié)論可以為以后奶山羊的育種提供一定的參考依據(jù)。

[1]Schmidt J A,Yvone G M,Brown W J.Membrane topology of human AGPAT3(LPAAT3)[J].Biochemical and Biophysical Research Communications.2010,397(4):661～667.

[2]Mistry D H,Depeters E J,Medrano J F.Comparative composition of total and sn-2 fatty acids in bovine and ovine milk fat [J].Lait.2002,82:255～259.

[3]Ye G M,Chen C,Huang S,et al.Cloning and characterization a novel human 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase gene AGPAT7[J].DNA Sequence-The Journal of Sequencing and Mapping,2005,16:386～390.

[4]Aben I F,Degano L,Calza F,et al.Milk quality and automatic milking:fat globule size,natural creaming,and lipolysis[J]. Journal of Dairy Science,2005,88:3519～3529.

[5]Bionaz M,Loor JJ.ACSL1,AGPAT6,FABP3,LPIN1,and SLC27A6 are the most abundant isoforms in bovine mammary tissue and their expression is affected by stage of lactation[J].J Nutr,2008a,138(6):1019～1024.

[6]昝林森,張佳蘭,劉新武.牛AGPAT6基因遺傳特征與奶牛產(chǎn)奶性能相關(guān)性研究[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(7): 1498～1503.

[7]Chen H,Leibenguth F.Studies onmultilocus finger-prints, RAPDmarkers and mitochondrial DNA of agynogenetic fish( carassiusauratusgibelio)[J].Bio-chemGenet,1995,33:297～306.

[8]Thering B J,Graugnard D E,Piantoni P,et al.Adipose tissue lipogenic gene networks due to lipid feeding and milk fat depression in lactating cows[J].Journal of Dairy Science,2009,9: 4290～4300.

[9]Chen Y Q,Kuo M S,Li S,et al.AGPAT6 is a novel microsomal glycerol-3-phosphate acyltransferase[J].J Biol Chem, 2008,283:10048～10057.

[10]Vergnes L,Beigneux A P,Davis R,et al.Agpat6 deficiency causes subdermal lipodystrophy and resistance to obesity[J]. Journal of Lipid Research,2006,47:745～754.

1004-2342（2014）03-0009-02

S813.3

B

2014-03-31）

渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年科研基金（WZYQ201215）。

常振華（1984～)，女，內(nèi)蒙古烏蘭察布市人，碩士，助教，主要從事牛、羊生產(chǎn)及育種工作。