不同熒光RT-PCR試劑盒檢測H7亞型禽流感病毒的比較

（廣州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510440）

不同熒光RT-PCR試劑盒檢測H7亞型禽流感病毒的比較

鄭麗蘭，張海明，張海冰，沈 丹，段曉冬

（廣州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510440）

[目的]比較評價(jià)4種H7亞型禽流感病毒熒光定量PCR試劑盒檢測結(jié)果的差異。[方法] 同時(shí)用4種H7亞型禽流感病毒熒光定量PCR試劑盒對已知結(jié)果的抗原和145份家禽泄殖腔棉拭子進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。[結(jié)果]WHO推薦的方法和廠家A的檢測試劑盒的靈敏度最好，在將H7禽流感抗原稀釋至1∶10-7時(shí)均能檢測到禽流感病毒；而廠家B的試劑盒在抗原濃度1∶10-4以上時(shí)均能檢測到禽流感病毒，但在1∶10-4至1∶10-7的稀釋度則只能判定為可疑，需要進(jìn)行重新檢測；廠家C的H7亞型禽流感病毒檢測試劑盒的靈敏度更差，只在抗原濃度1∶10-3以上時(shí)顯示陽性，抗原濃度為1∶10-6和1∶10-7時(shí)均不能檢測到H7亞型禽流感病毒。另外，4種試劑盒均表現(xiàn)出較好的特異性和重復(fù)性。[結(jié)論]不同廠家H7亞型禽流感病毒檢測試劑盒的靈敏度等方面存在一定差異，WHO推薦的H7亞型禽流感病毒檢測方法和廠家A的總體性能優(yōu)于試劑盒B和C，適于臨床檢測與篩查。

禽流感病毒；H7亞型；熒光RT-PCR；比較

2013年2月以來，我國浙江、江蘇、廣東等十多個(gè)省份相繼出現(xiàn)人感染H7N9亞型禽流感病毒的事件[1-2]，截止到2013年10月25日，已經(jīng)造成137人感染，其中45人死亡[3-6]。該事件給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-9]。同年5月18日，我單位在日常例行監(jiān)測工作中，在廣州市增城某市場檢測到H7N9亞型禽流感病毒，并及時(shí)采取相應(yīng)的措施，為防止病毒擴(kuò)散和預(yù)防我市市民感染H7N9亞型禽流感起到了十分重要的作用。眾所周知，采取相應(yīng)的措施控制疫情擴(kuò)散的前提之一即為快速、準(zhǔn)確地對疫情進(jìn)行檢測和確診。由于H7N9亞型禽流感感染家禽后不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀[10-11]，因此，利用實(shí)驗(yàn)室檢測方法對其進(jìn)行及時(shí)檢測和確診顯得尤為重要，而熒光RT-PCR方法作為一項(xiàng)快速、高度敏感、高度特異和高通量檢測新型檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于包括H7N9禽流感病毒檢測在內(nèi)的動(dòng)物疫病檢測工作中，并成為多種病原檢測的首選方法[12-13]。

目前，市場上針對H7亞型禽流感病毒的熒光RT-PCR檢測試劑盒種類較多，但由于試劑盒生產(chǎn)企業(yè)的擴(kuò)增目的片段不盡相同及其技術(shù)平臺(tái)不同，不同試劑的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率等方面可能存在一定的差異，因此，為保證檢測的準(zhǔn)確性和疫情控制的及時(shí)性，本試驗(yàn)對目前市場上的幾種主要的H7亞型禽流感熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行比較，分析其檢測的敏感性和特異性，為試劑盒的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

H7亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒分別購自目前市場上較為常見的三家公司，分別命名為廠家A、廠家B和廠家C ；世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的H7亞型引物和探針由英韋創(chuàng)津（上海）貿(mào)易有限公司合成，序列見表1； RNA提取試劑盒購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（美國ABI公司）。

表1 H7亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)RT-PCR的引物和探針序列

1.2 主要儀器

AB I 7500實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增儀，Kingfsher Flex磁珠分選純化儀。

1.3 陽性樣品

H7亞型禽流感抗原（H7N9禽流感毒株，批號(hào)2013001）、H5亞型禽流感HA抗原和H9亞型禽流感檢測陽性抗原購自哈爾濱獸醫(yī)研究所（批號(hào)分別為2013002和2012002）；新城疫病毒HA抗原購自北京中海生物技術(shù)有限公司（批號(hào)為20130601）。

1.4 臨床樣品來源

145份家禽泄殖腔棉拭子源自本所2013年4～6月對廣州市家禽交易市場例行監(jiān)測的樣品。

1.5 方法

1.5.1 核酸提取

嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作：于試劑板樣品孔中加入50 uL經(jīng)充分振蕩混懸的樣品液體，隨后每孔分別加入130 uL裂解液和20 uL磁珠Enhancer混合液（1∶1混合），再將所有試劑板置于Kingfsher Flex磁珠分選純化儀進(jìn)行核酸提取。陰、陽性樣品操作同待檢樣品。

1.5.2 核酸檢測和結(jié)果判定

WHO推薦的H7亞型禽流感病毒檢測方法按WHO推薦的程序進(jìn)行；其它三個(gè)不同廠家的檢測試劑盒按說明書進(jìn)行操作，并按照試劑盒說明書判定標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判定。

1.5.3 靈敏性試驗(yàn)

將H7亞型禽流感抗原按10倍稀釋成不同濃度（即7個(gè)滴度，分別為 1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000至1∶10-7），再用不同試劑盒同時(shí)進(jìn)行檢測以比較不同試劑盒的靈敏性。

1.5.4 特異性試驗(yàn)

分別對H5亞型禽流感HA抗原、新城疫病毒HA抗原和H9亞型禽流感檢測HA抗原（各2個(gè)重復(fù)）進(jìn)行核酸抽提，隨后分別用上述4種H7亞型實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測。

1.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

對上述未稀釋以及10倍稀釋的H7亞型禽流感HA抗原進(jìn)行核酸提取后，分別應(yīng)用上述4種實(shí)時(shí)RT-PCR方法進(jìn)行多次重復(fù)測定（n = 4），并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其重復(fù)性。

1.6 臨床樣品的檢測

用上述4種檢測試劑盒對臨床采集的145份家禽泄殖腔棉拭子進(jìn)行H7亞型禽流感病毒的檢測，結(jié)果檢出1份陽性和144份陰性，4種H7亞型熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測結(jié)果一致。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 敏感性

以10倍梯度稀釋的H7亞型禽流感抗原提取的RNA為模板，用四種熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，并根據(jù)各自結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，發(fā)現(xiàn)WHO推薦的方法和廠家A的試劑盒檢測均為陽性；而廠家B的試劑盒在10-4的稀釋度以下均為陽性，而稀釋度為10-5到10-7時(shí)均為可疑；用廠家C的試劑盒檢測時(shí)，抗原稀釋度在10-3以下時(shí)均為陽性，而在10-4和10-5時(shí)均為可疑，10-6和10-7時(shí)則均為陰性（表2）。對判定為可疑的樣品，根據(jù)試劑盒說明書的要求進(jìn)行了重復(fù)檢測，結(jié)果均為陽性。

表2不同試劑盒靈敏性與結(jié)果判定比較

2.2 特異性

四種實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒均能檢出H7亞型禽流感病毒，而對H5亞型禽流感HA抗原、新城疫病毒HA抗原和H9亞型禽流感均不能檢測到任何熒光信號(hào)，說明這幾種檢測試劑盒特異性均較好。

2.3 重復(fù)性

重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度參比樣品進(jìn)行了4次檢測，4種熒光定量RT-PCR檢測方法的變異系數(shù)均小于5%（表3），說明4種熒光定量PCR試劑盒都具有良好的結(jié)果重復(fù)性。

表3 4種實(shí)時(shí)RT-PCR方法的重復(fù)性比較

3 討論

H7亞型禽流感病毒最先的報(bào)道是1902年的高致病性H7N7亞型禽流感病毒（A/Chicken/Brescia/1902（H7N7）），曾被認(rèn)為是“雞瘟（FEV）”[14]。近年來，全球范圍內(nèi)家禽中H7亞型禽流感已導(dǎo)致超過7000萬家禽死亡，不僅波及美國、加拿大、智利等美洲國家，也波及巴基斯坦、德國、荷蘭等亞歐國家，涉及H7N1、H7N3、H7N4、H7N7等低致病性毒株的多種亞型以及H7N1、H7N2、H7N3、H7N8 、H7N9等高致病性毒株的多種亞型[14]。2003年以前，人感染H7亞型禽流感的報(bào)道較少，且一般為實(shí)驗(yàn)室感染。2013年以前在人群中最大規(guī)模的暴發(fā)是在2003年的荷蘭，該次H7N7亞型禽流感疫情共造成80余人感染，還導(dǎo)致了3000多萬家禽死亡[15-16]。2013年3月，我國上海和安徽兩地首先發(fā)現(xiàn)3例人感染新型重配H7N9亞型禽流感病毒的病例，在隨后的幾個(gè)月時(shí)間里，我國又有十多個(gè)省市陸續(xù)報(bào)道人感染和死亡，H7N9亞型禽流感不僅對公眾健康的造成了巨大的威脅，也給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失[9，17-18]。人感染H7N9禽流感事件發(fā)生后，病毒檢測與分離、基因測序等工作迅速開展，特別是實(shí)時(shí)RT-PCR等快速檢測方法的及時(shí)建立與應(yīng)用，為動(dòng)物衛(wèi)生部門和衛(wèi)生部門對H7N9亞型禽流感感染的及時(shí)確診和有效處置提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支持[19-20]。但是，隨著商品化檢測試劑的推出，在為檢測工作帶來便利的同時(shí)，由于不同廠家試劑盒的敏感性、特異性等有所差異，導(dǎo)致結(jié)果會(huì)有所偏差，有的甚至?xí)z。因此需要對這些商品化試劑盒進(jìn)行評估，以便為選擇最合適的試劑盒以對H7N9亞型禽流感病毒的確診提供技術(shù)依據(jù)。

本試驗(yàn)中所選的3個(gè)廠家的試劑盒是目前國內(nèi)H7亞型禽流感檢測常用的試劑盒，而WHO推薦的檢測方法也是目前公認(rèn)較為標(biāo)準(zhǔn)的H7禽流感檢測方法。我們試驗(yàn)表明，WHO推薦的檢測方法和3個(gè)廠家的試劑盒均具有較好的特異性和重復(fù)性，但是依據(jù)各自判定標(biāo)準(zhǔn)的靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種檢測方法之間差別較大：WHO推薦的方法和廠家A的檢測試劑盒的靈敏度最好，在將H7禽流感抗原稀釋至1∶10-7時(shí)均能檢測到禽流感病毒；而廠家B的試劑盒在抗原濃度1∶10-4以上時(shí)均能檢測到禽流感病毒，但在1∶10-4至1∶10-7的稀釋度則只能判定為可疑，需要進(jìn)行重新檢測；廠家C的H7亞型禽流感病毒檢測試劑盒靈敏度較差，只在抗原濃度1∶10-3以上時(shí)顯示陽性，抗原濃度為1∶10-6和1∶10-7時(shí)均不能檢測到H7亞型禽流感病毒。由于檢測的靈敏度不高，當(dāng)待檢樣品中病毒濃度不高時(shí)，使用廠家B的H7禽流感病毒檢測試劑盒可能出現(xiàn)較多的“可疑”的檢測結(jié)果，需要進(jìn)行重復(fù)檢測，這樣不僅增加了檢測成本和人力成本，更重要的是增加了檢測所需要的時(shí)間，可能導(dǎo)致疫情診斷甚至處理的延誤。而對于廠家C的H7禽流感病毒檢測試劑盒，一旦樣品中病毒含量較低時(shí)，很可能出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象。

由于H7N9亞型禽流感病毒感染家禽后只表現(xiàn)輕微的臨床癥狀甚至不表現(xiàn)癥狀，而該病毒又能引起重大的公共安全問題，因此對于該病毒的檢測需要敏感性較高的試劑，以便避免可能的漏檢給H7N9亞型禽流感的防控工作帶來風(fēng)險(xiǎn)。鑒于此，我們認(rèn)為WHO推薦的H7亞型禽流感病毒檢測方法和廠家A的檢測試劑盒試劑對于H7亞型禽流感病毒的快速檢測更為合適。

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Comparison of different real-time RT-PCR kits for detection of H7 subtype avian infuenza virus

Zheng Lilan，Zhang Haiming，Zhang Haibing，Shen Dan，Duan Xiaodong

（Guangzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Guangdong，Guangzhou，510440）

[Objective]To compare and evaluate the effcacy of the four real time RT- PCR diagnostic kits for H7 avian infuenza virus. [Methods]The H7 subtype antigen and 145 cloacal swabs of poultry with known results were detected by the four kits （the WHO recommended kit，Kit A，Kit B and Kit C） and their results were statistically analyzed.[Result]The WHO recommended method and Kit A had the highest sensitivity in detection of H7 virus with the dilution of 1∶10-7. The virus could be detected at the antigen concentration above 1∶10-4and 1∶10-3by Kit B and Kit C respectively. The virus could not be detected when the antigen dilution was 1∶10-6and 1∶10-7using Kit C showing the lowest sensitivity. However，all the four kits showed good specifcity and repeatability. [Conclusion]Different kits for H7 subtype avian infuenza virus had different performance of sensitivity. The overall performance of the WHO method and Kit A was better than the other two kits in screening and clinical surveillance.

avian infuenza virus；H7 subtype；real-time RT-PCR；comparison

S852.659.5；S859

：B

：1005-944X（2014）09-0073-04