藏藥二十一味寒水石丸中的總鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定

朱林燕, 孔子銘, 謝建峰, 韓泳平

(西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所, 成都 610041)

藏藥二十一味寒水石丸中的總鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定

朱林燕, 孔子銘, 謝建峰, 韓泳平

(西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所, 成都 610041)

目的: 建立二十一味寒水石丸中總鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定方法.方法: 以干酪素作為吸附劑, 堿性條件下顯色, 以磷鉬鎢酸為氧化劑, 用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定鞣質(zhì)含量; 采用HPLC法同時(shí)測(cè)定沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量. 使用迪馬Diamonsil-2 C18(4.6 mm×250mm, 5μm)色譜柱, 以乙腈--0.1磷酸水梯度洗脫, 體積流量分別為1.0mL/min, 柱溫為30℃; 檢測(cè)波長(zhǎng)270nm, 測(cè)定.結(jié)果: 以沒(méi)食子酸計(jì)的鞣質(zhì)含量在0.5～5μg·ml-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r＝0.9991), 平均回收率為95.77%, RSD為0.70%(n＝6); 沒(méi)食子酸在0.32～1.6μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為98.70%, RSD為1.01%(n=9), 鞣花酸在0.372～.1.86μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999),平均回收率為99.63%, RSD為0.75%(n=9).結(jié)論: 本方法準(zhǔn)確、可靠簡(jiǎn)便, 具有較強(qiáng)專屬性, 可用于常用藏藥二十一味寒水石丸中總鞣質(zhì)、沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定.

二十一味寒水石丸; 干酪素法; 總鞣質(zhì); 沒(méi)食子酸; 鞣花酸

二十一味寒水石丸為藏醫(yī)臨床常用藥, 用于培根木布病即胃潰瘍等胃腸道疾病的治療[1], 是由寒水石、渣馴膏、波棱瓜子、止瀉木子、木瓜、紫檀香、石榴子、豆蔻子、牛黃、甘青青蘭、蓮座虎耳草、綠絨蒿、余甘子、榜嘎、沙棘膏、蓽菝、獐牙菜、藏木香、塞北紫堇、木香、訶子等21味藥材組成. 處方中訶子和余甘子等藥材中富含鞣質(zhì)類成分,一方面具有收斂止血等多方面功效[2],另一方面還有沉淀蛋白或凝集蛋白等作用[3],此外, 還通過(guò)對(duì)酶發(fā)生作用凝固微生物體內(nèi)原生質(zhì), 表現(xiàn)出抑制病毒和細(xì)菌的生長(zhǎng)等活性[4-6]. 鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物包括沒(méi)食子酸和鞣花酸, 也有有著重要的生理功能[7],鞣質(zhì)及其水解產(chǎn)物都是復(fù)方治療胃病的活性組分, 因此, 準(zhǔn)確測(cè)定地測(cè)定二十一味寒水石丸中沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量[8-10],能為該制劑的質(zhì)量控制和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供更全面的科學(xué)依據(jù). 同時(shí)本文還采用干酪素法建立了測(cè)定二十一味寒水石丸中總鞣質(zhì)含量的[11]方法, 為二十一味寒水石丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制提供了依據(jù).

1 儀器與試劑

Waters2695型高效液相色譜儀; 2996 PDA檢測(cè)器; KQ-250B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); METTLER TOLEDO AE240電子分析天平[梅特勒一托利多儀器(上海) 有限公司]; 紫外分光光度計(jì), 沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)110831-200803, 中國(guó)食品藥品檢定研究院), 鞣花酸(購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心, 批號(hào)08-2005)干酪素(成都市科龍化工試劑廠, 化學(xué)純, ), 所用試劑除甲醇、乙腈為色譜純外, 其余為分析純, 去離子水, 樂(lè)百氏水, 磷鉬鎢酸試液自制. 二十一味寒水石丸(由阿壩藏族羌族自治州藏醫(yī)院提供, 批號(hào)：20130401、20130402、20130403).

2 總鞣質(zhì)的含量測(cè)定

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)掃描, 發(fā)現(xiàn)總酚、不被吸附的酚和沒(méi)食子酸對(duì)照品試液都在760nm處有吸收, 故確定實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)為760nm.

2.2 磷鉬鎢酸溶液

取鉬酸鈉2.5g和鎢酸鈉10g, 加水70ml使其溶解, 再加鹽酸10ml、磷酸5ml, 加熱回流10小時(shí), 自然冷卻,加硫酸鋰15g、水5ml和溴0.02ml, 并煮沸除去殘留的溴(大約是15min), 冷卻, 加水稀釋到100ml, 濾過(guò), 得磷鉬鎢酸自制溶液. 本液不能顯綠色 (若放置的溶液過(guò)后變?yōu)榫G色, 可加溴0.02ml, 可以煮沸除去多余的溴).

2.3 干酪素用量選擇

對(duì)干酪素的用量的選擇, 目的是評(píng)價(jià)鞣質(zhì)沉淀的效率. 即分別取0.2g、0.4g、0.6g、0.8g和1.0g的干酪素去沉淀同樣重量的樣品. 當(dāng)干酪素重量為0.6g時(shí),測(cè)定的鞣質(zhì)的含量趨于穩(wěn)定, 不被吸附的多酚含量不再繼續(xù)減少,據(jù)此說(shuō)明鞣質(zhì)已經(jīng)被干酪素完全吸附. 由此確定干酪素的用量是0.6g.

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取25 mg沒(méi)食子酸對(duì)照品, 放置于100mL棕色容量瓶中, 加入少量水溶解, 搖勻, 稀釋至刻度, 并精密量取5mL, 置于50mL棕色量瓶中, 搖勻, 用水稀釋至刻度, 即得0.025mg/mL 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液.

2.5 線性關(guān)系的考察

分別取對(duì)照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0 mL, 置于25 mL 棕色容量瓶中, 并分別磷鉬鎢酸溶液各1mL, 然后向各個(gè)棕色容量瓶中加水分別為11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7 mL, 并用29%碳酸鈉試液稀釋到刻度, 定容, 搖均勻, 并放置30分鐘, 配制相應(yīng)的空白試液, 依據(jù)紫外-可見(jiàn)分光光度法, 在760nm處測(cè)定吸光度的值. 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo), 吸光度值為縱坐標(biāo), 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝0.1154C-0.0157, r＝0.9991, 表示沒(méi)食子酸在0.5～5μg/mL有良好的線性關(guān)系.

2.6 樣品中鞣質(zhì)含量的測(cè)定

2.6.1 供試品的制備

取二十一味寒水石丸, 粉碎, 精密稱定1.00g, , 置250mL棕色量瓶中, 加入去離子水150mL, 浸置30min,超聲30 min, 冷卻, 加去離子水稀釋到刻度, 搖均勻, 靜置并使試液中固體沉淀,過(guò)濾, 去掉50mL初濾液, 精密取續(xù)濾液20mL 于100mL棕色容量瓶中, 加水定容到刻度, 搖勻, 即得供試品溶液.

2.6.2 總酚含量測(cè)定

精密量取供試品試液2mL, 置25mL棕色容量瓶中, 按“2.6”項(xiàng)下的方法操作(加入磷鉬鎢酸1mL, 加水10mL,用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度, 搖勻, 放置30 min), 測(cè)定吸光度值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品試液中沒(méi)食子酸的含量, 并由此計(jì)算供試品溶液中總酚的量.

2.6.3 不被吸附的多酚的測(cè)定

取供試品溶液25mL, 加到已經(jīng)放有0.6g干酪素的250mL錐形瓶中,密塞,放置于水浴鍋中(30℃)恒定溫度1h,經(jīng)常振搖, 取出, 自然冷卻, 搖勻, 過(guò)濾, 棄掉初始濾液, 精密取續(xù)濾液2mL, 置25mL棕色容量瓶中, 按“2.6”項(xiàng)下的方法操作(加入磷鉬鎢酸1mL, 加水10mL, 用 29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度, 搖勻, 放置30min), 在760nm處依法測(cè)定吸光度值, 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試品溶液以沒(méi)食子酸量, 并由此計(jì)算出不被吸附的多酚的量.

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取6份對(duì)照品溶液2ml, 按照“2.6”的方法操作測(cè)定, 計(jì)算RSD為0.6%, 說(shuō)明此方法精密度好.

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液, 按“2.6”項(xiàng)下方法操作, 分別于0、1、2、3、4、5、6h測(cè)定鞣質(zhì)的含量, 結(jié)果表明, 6h內(nèi)鞣質(zhì)平均量為0.66%, RSD為1.2%. 由此可得出結(jié)論, 樣品中在6h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.7.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱定同一批號(hào)的樣品細(xì)粉1.0g, 共 6份, 按“2.6”項(xiàng)下操作, 測(cè)得二十一味寒水石丸中總鞣質(zhì)的平均量為 3.52%, RSD為1.23%. 說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好.

2.7.4 加樣回收試驗(yàn)

精密取已知含量的樣品細(xì)粉1.0g, 一共6份, 分別精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品的量為10.0mg, 并按 “2.6”項(xiàng)下方法操作, 計(jì)算回收率. 結(jié)果測(cè)定平均回收率為95.77%, RSD為0.70%.

2.8 樣品測(cè)定

取3批二十一味寒水石丸(批號(hào) 130401、130402、130403), 分別按“2.6”項(xiàng)下方法測(cè)定, 結(jié)果總鞣質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 3.53 %、 3.52%、3.57% (n＝3) .

3 沒(méi)食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜條件C18色譜柱(4.6mm×250mm); 洗脫程序見(jiàn)表1; 檢測(cè)波長(zhǎng)270nm; 流速為1.0mL/min; 柱溫30℃; 進(jìn)樣體積10μL.

表1 梯度洗脫程序表Tab 1 Gradient elution program

3.2 溶液的制備

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備

并分別精密稱取鞣花酸對(duì)照品18.6mg、沒(méi)食子酸對(duì)照品16mg, 置于100ml的容量瓶中, 加甲醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻得沒(méi)食子酸和鞣花酸的混合對(duì)照品溶液(鞣花酸、沒(méi)食子酸分別為為0.186mg·ml-1、0.16mg·ml-1).

3.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取本品2.0g, 置100mL具塞錐形瓶中, 用50%甲醇50mL溶解, 并稱定重量. 超聲提取30min, 自然冷卻, 稱重, 用50%溶劑補(bǔ)足失重, 并搖勻, 濾過(guò), 棄去初濾液, 取續(xù)濾液, 即得沒(méi)食子酸、鞣花酸含量測(cè)定溶液.

3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

3.3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取供試品溶液、含沒(méi)食子酸和鞣花酸的混合對(duì)照品溶液各10μL, 注入高效液相色譜儀, 并按“3.1”色譜條件進(jìn)行分析, 沒(méi)食子酸在8.1min左右出峰, 鞣花酸在40.1min左右出峰, 峰型尖銳、對(duì)稱, 結(jié)果在與理論板數(shù)按沒(méi)食子酸和鞣花酸計(jì)算均不低于3000, 沒(méi)食子酸和鞣花酸與相鄰峰的分離度大于1.5. 見(jiàn)圖1：

3.4 線性關(guān)系考察

精密稱取沒(méi)食子酸和鞣花酸混合對(duì)照品溶液2, 4, 6, 8, 10ml置于10ml的容量瓶中, 加甲醇稀釋至刻度, 搖勻, 分別取10μL注入高效液相色譜儀. 以峰面積和濃度進(jìn)行線性回歸, 得回歸方程, 見(jiàn)表2.

3.5 精密度試驗(yàn)

按“3.3”項(xiàng)下操作,取沒(méi)食子酸、鞣花酸混合對(duì)照品溶液10μL, 分別連續(xù)進(jìn)樣5次, 測(cè)得沒(méi)食子酸、鞣花酸峰

面積的RSD分別為0.78%, 0.89%, 結(jié)果表明精密度良好.

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液液, 室溫放置, 分別在0、4、8、10、12h取樣10μL在高效液相色譜儀上進(jìn)樣, 記錄峰面積, 計(jì)算沒(méi)食子酸及鞣花酸RSD分別為0.15%、0.56%.

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

圖1 供試品品以及沒(méi)食子酸、鞣花酸混合對(duì)照溶液的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference of gallic acid, ellagic acid and sample

表2線性關(guān)系Tab.2 Linear correlation

精密稱取樣品5份, 按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在高效液相色譜儀上以10μL進(jìn)樣, 記錄峰面積,并計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù). 結(jié)果沒(méi)食子酸、鞣花酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.16mg.g-1、2.8474mg.g-1; RSD分別為0.12%、0.24%, 結(jié)果表明重現(xiàn)性良好.

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)沒(méi)食子酸、鞣花酸的二十一味寒水石丸(20130401)粉末9份, 每份樣品約2.0g, 測(cè)沒(méi)食子酸時(shí),每三份各分別精密加入混合對(duì)照品溶液(含沒(méi)食子酸、鞣花酸分別為0.16mg·ml-1、0.186mg·ml-1,)22ml、27mL、

32mL, 測(cè)鞣花酸時(shí), 每三份各精密加入混合對(duì)照品溶液分別為24.5L、30mL、36.5mL; 按上述“3.2.2”項(xiàng)下制備方法和“3.1”色譜條件, 制備加樣回收供試品溶液, 注入高效液相色譜儀,進(jìn)行測(cè)定分析, 計(jì)算回收率.結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 加樣回收率試驗(yàn)(n=9)Tab.3 Result of recovery tests (n=9)

4 樣品測(cè)定

取3批樣品, 按3.3項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積, 每份平行測(cè)定3次, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算沒(méi)食子酸、鞣花酸的質(zhì)量濃度, 結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 沒(méi)食子酸、鞣花酸含量的測(cè)定(n=3)Tab.4 Determination result of samples(n=3)

5 討論

5.1 鞣質(zhì)含量測(cè)定討論

根據(jù)2010版《中國(guó)藥典》(一部)附錄XB鞣質(zhì)含量測(cè)定, 該實(shí)驗(yàn)用沒(méi)食子酸作為對(duì)照品, 鞣質(zhì)屬于多酚類物質(zhì), 通過(guò)對(duì)磷鉬鎢酸的還原反應(yīng), 生成藍(lán)色的絡(luò)合物, 吸收光強(qiáng)度與酚含量存在正相關(guān)的關(guān)系, 采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定鞣質(zhì)含量. 此方法較原來(lái)2000版《中國(guó)藥典》皮粉重量法準(zhǔn)確, 在專屬性和測(cè)定精密度方面都有了提高. 此外, 本法采用水提取鞣質(zhì), 再以干酪素沉淀非鞣質(zhì)類成分, 兩者之差即為鞣質(zhì)含量. 考慮到在鞣質(zhì)含量測(cè)定過(guò)程中, 需避光操作, 加之濾紙對(duì)鞣質(zhì)有一定的吸附,故在供試品溶液的制備過(guò)程中, 需棄去初濾液, 取續(xù)濾液, 以防止含量偏低.

5.2 提取溶劑的選擇

本研究曾對(duì) 30%甲醇超聲、50%甲醇超提取、提取70%甲醇超聲提取, 以及提取時(shí)間、溫度等提取方式和提取條件進(jìn)行考察, 結(jié)果表明提取條件定為50%甲醇在超聲提取30min的條件下提取率較為穩(wěn)定, 為最佳實(shí)驗(yàn)條件.

5.3 流動(dòng)相的選擇

本文剛開(kāi)始采用的是等度洗脫, 分離效果不佳. 后來(lái)與相關(guān)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行比較、試驗(yàn), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫法的效果更好. 經(jīng)過(guò)多次調(diào)整乙腈-水的配比, 選擇了本文的洗脫程序作為流動(dòng)相, 能更好的將對(duì)照峰與雜質(zhì)峰分開(kāi), 分離度和拖尾因子均符合2010年版《中國(guó)藥典》要求, 且峰形更好干擾較小.

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Determination of total tannins, gallic acid and ellagic acid in Ershiyiwei Hanshuishi pill

ZHU Lin-yan, KONG Zi-ming, XIE Jian-feng, HAN Yong-ping
(Ethnic Pharmaceutical Institute of Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:To establish a stable method for determination of total tannins, gallic acid and ellagic acid in Ershiyiwei Hanshuishi pill.Methods:The UV-vis method was used to determine the content of total tannins of Ershiyiwei Hanshuishi pill with casein as sorbent, phosphorus molybdenum-tungsten acid as oxidant. Gallic acid and ellagic acid were determined by HPLC. The Diamonsil-2 C18column(4.6 mm×250 mm, 5μm) column was used with gradient elution. Mobile phase was composed of acetonitrile-0.1% phosphoric acid in solution, and the flow rate was 1 mL/min．The column temperature was kept at 25 ℃.The detection wavelength was set at 270 nm. Results: The linear relationship of standard curve was good within the range of 0.5—5μg/mL, r = 0.9991,and the average recovery was 95.77% with RSD of 0.70% (n=6). The linear range of gallic acid was 0.32～1.6μg(r=0.9999), and the average recovery rate was 98.70%, with RSD of 1.01%. The linear range of ellagic acid was 0.372～1.86μg(r=0.9999), the average recovery rate was 99.63% with RSD of 0.75% respectively.Conclusion:The method is accurate, reliable, specific and can be used to determine the total tannins, gallic acid and ellagic acid in Ershiyiwei Hanshuishi pill .

Ershiyiwei Hanshuishi pill; casein method; total tannins; gallic acid; ellagic acid

R284; R29

: A

: 1003-4271(2014)03-0388-06

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.11

2014-03-025

韓泳平(1965-), 男, 四川成都人, 教授, 碩士生導(dǎo)師. E-mail: yphan65@tom.com.

科技部十二五支撐計(jì)劃資助(2012BAI27B07); 西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目資助(CX2014SP262)