豬流行性腹瀉病毒部分S1基因克隆

王蓓 陳如圣 孫明 張祥華 潘美慧 熊加明 鄔向東何后軍 陳瑞光

（江西農(nóng)業(yè)大學動科院，江西 南昌 330045）

豬流行性腹瀉病毒部分S1基因克隆

王蓓 陳如圣 孫明 張祥華 潘美慧 熊加明 鄔向東*何后軍 陳瑞光

（江西農(nóng)業(yè)大學動科院，江西 南昌 330045）

為研究江西省PEDV流行株可能的變異情況，作者采用RT-PCR成功擴增了PEDV的部分S1基因，并將其克隆至T載體，經(jīng)測序同源性分析，與PEDV標準毒株同源性在95%以上，說明成功的克隆了PEDV病毒部分S1基因，為將來進一步研究打下基礎。

豬流行性腹瀉；分子流行病學調(diào)查；同源性

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是引發(fā)豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）的原因。其屬于冠狀病毒科，冠狀病毒亞科甲型冠狀病毒屬b亞群[1]。PED對于不同年齡段及不同品種的豬都容易感染，是豬的一種擁有高度接觸性的傳染病，以哺乳仔豬最為嚴重，死亡率可達100%，該病在我國及世界各養(yǎng)豬國家普遍分布。其主要的臨床癥狀以食欲不振、水樣腹瀉、嘔吐、脫水，最后酸中毒為基本特征。以往該病雖給養(yǎng)豬業(yè)造成了極其嚴重的影響，但病毒感染往往在一周后即基本恢復，病程較短[2]。但最近幾年，該病在我國發(fā)生率明顯升高，而且病程拖長，給養(yǎng)豬場造成極其嚴重的損失[3]。本研究根據(jù)NCBI發(fā)表的PEDV標準毒株序列設計引物，通過RT-PCR方法，擴增出預期大小基因片段，經(jīng)克隆測序，證實本研究成功克隆到PEDV-S1基因，為進一步研究其變異性提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源。采集江西省南昌市某縣豬場疑似病毒性腹瀉仔豬的小腸組織及糞便樣品。

1.1.2主要設備。K960型梯度PCR擴增儀，5415R型eppendorf高速臺式冷凍離心機，JY300C型電泳儀、JY02S型紫外分析系統(tǒng)，SPX-150B-Z型上海博迅生化培養(yǎng)箱，DW-FL262型-40℃中科美菱超低溫冷凍儲存箱等。

1.1.3主要試劑。氨芐青霉素、LB培養(yǎng)基、SDS、Tris堿等（Solarbio公司產(chǎn)品）；EcoRⅠ、SalⅠ、PCR mix、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等（普洛麥格公司）；Trizol Kit、DNA凝膠回收純化Kit與PMD18-T Vector（大連寶生公司）。

1.2方法

1.2.1PEDV部分S1基因的RT-PCR擴增方法建立

1.2.1.1引物設計。根據(jù)GenBank上已發(fā)表PEDV-S基因序列設計引物，預期大小為1 139bp，由上海生工生物工程公司合成。引物序列：

P1：5'-------TTCACTGGTCATGGCACTGAC --------3'

P2：5'-------CTAACAGGCGTGTTGTAAAGC TG----3'

1.2.1.2病毒RNA的提取。取約50mg病料，加入有1mL生理鹽水的勻漿器中充分研磨后，12 000×g離心3min，取上清用于總RNA提取。

1.2.1.3PEDV反轉(zhuǎn)錄反應體系。無菌2H2O 4.5μL、dNTP 4μL、5×buffer 4μL、P2 1μL、RNA酶抑制0.5 μL、M-MLV 1μL、RNA模板5μL。反應條件：42℃

50min，72℃15min，獲得cDNA置-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4RT-PCR退火溫度確定。反應條件：94℃預變性5min；94℃45s，56.3℃、57.1℃、57.9℃、59.0℃、60.0℃、61.1℃、62.2℃、63.3℃、64.2℃9個梯度45s，72℃90s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應體系：無菌2H2O 8.5 μL、cDNA 2 μL、PCR mix 12.5 μL、P1 1 μL、P2 1μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.1.5RT-PCR反應敏感性檢測。將cDNA模板做10倍遞度稀釋，采用10～106倍稀釋樣品進行擴增，以無菌2H2O做空白對照，用優(yōu)化后的RT-PCR最佳的反應程序進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.1.6RT-PCR反應特異性試驗檢測：選擇PEDV、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）陽性樣品反轉(zhuǎn)錄的cDNA、偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒（PCV2）陽性樣品提取的DNA作為PCR反應模板，用優(yōu)化后的最佳的反應條件進行擴增，設無菌2H2O為空白對照。

1.2.2PEDV部分S1基因克隆及同源性分析

1.2.2.1PEDV部分S1基因PCR擴增。以保存的cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系同1.2.1.4。應用1.2.1優(yōu)化的反應條件進行PCR反應，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.2.2目的片段回收及載體連接。將待回收的PEDV-S1基因DNA片段在90V電壓45min 1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用TaKaRa公司DNA回收試劑盒回收純化DNA片段。回收片段與PMD18-T Vector載體進行連接，連接反應的體系如下。

輕輕混勻，置16℃水浴鍋中連接2h，然后將其放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。參考分子克隆實驗指南方法制備感受態(tài)細胞，采用CaCl2轉(zhuǎn)化法進行，將連接S1基因的克隆載體PMD18-T-S1轉(zhuǎn)入宿主菌DH5α。

1.2.2.4重組菌的鑒定。用無菌牙簽隨機挑取轉(zhuǎn)化菌

落，轉(zhuǎn)接含氨芐青霉素的LB（LA）培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)12～16h。再將新鮮生長的轉(zhuǎn)化菌落轉(zhuǎn)接至LA液體培養(yǎng)基，參照分子克隆實驗指南[4]堿裂解法提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切體系如下。重組質(zhì)粒酶切37℃水浴2h后，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，分析酶切產(chǎn)物。

1.2.2.5基因序列的測定與分析。將經(jīng)雙酶切鑒定為陽性的重組菌液，送上海生工生物公司進行克隆基因測序，所得結(jié)果利用SeqMan軟件進行基因序列的拼接。根據(jù)所得到的基因序列，利用DNAStar軟件分析其流行特征，并且與標疫苗株進行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1PEDV的部分S1基因RT-PCR擴增方法建立結(jié)果

2.1.1PEDV RT-PCR反應最適退火溫度的試驗結(jié)果，見圖1。

圖1 PEDV最佳退火溫度電泳圖

2.1.2PEDV RT-PCR敏感性試驗結(jié)果見圖2。

圖2 PEDV敏感性檢測電泳圖

2.1.3PEDV RT-PCR特異性試驗結(jié)果見圖3。

圖3 PEDV引物特異性電泳圖

2.2豬流行性腹瀉病毒部分S基因的克隆及序列流行病學分析結(jié)果

2.3.1PEDV部分S1基因的RT-PCR擴增結(jié)果。樣本cDNA模板在最優(yōu)條件下進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果如圖4。可見一條約1 100bp的DNA片段，與預期的DNA片段大小一致。

圖4 S基因的PCR擴增

2.3.2PEDV-S1基因克隆與鑒定。提取的重組克隆質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果如圖5?？梢娭亟M克隆質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，有一條大片段（克隆載體DNA，約3 000 bp）和一小片段（插入的PEDV部分S1基因片段，約1 100 bp）。

圖5 S基因重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3.3PEDV部分S1基因克隆測序結(jié)果與同源性分析。南昌地區(qū)PEDV流行株S1基因與比利時標疫苗株CV777的同源性為95.7%，證實本試驗克隆的外源基因為PEDV部分S1基因。

3 小結(jié)與討論

3.1本試驗建立了PEDV部分S1基因的RT-PCR擴增方法，經(jīng)測序分析，與PEDV標準疫苗毒株同源性在95.7%，證實成功克隆PEDV-S1基因。

3.2本試驗建立的PEDV基因擴增方法具有較好的靈敏度和特異性，也可以應用該法對可疑病毒性腹瀉仔豬病料進行檢測，本試驗組從采集自江西省南昌市44份病料進行的檢測中發(fā)現(xiàn)，PEDV陽性率在63.64%。

[1]陸承平主編，獸醫(yī)微生物學（第五版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[2]蔡寶祥主編，家畜傳染病學（第四版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[3]徐國棟，李峰，張廣峰.國內(nèi)豬流行性腹瀉防治概況[J].畜牧與獸醫(yī)，2012（12）：10～12.

[4]J.莎姆布魯克[美]著.黃培堂譯.分子克隆實驗指南[M].北京：科學出版社，2005.

[5]王曉夢，牛貝貝，燕賀等.2010～2012年中國豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[C].中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術研討會論文集，徐州，2013.10.21.

[6]董世娟,朱于敏,于瑞嵩，等.我國PEDV分子流行病學研究進展[C].中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術研討會論文集，徐州，2013.10.21.

[7]孫明.江西省PEDV分子流行病學調(diào)查[D].江西農(nóng)業(yè)大學碩士論文，南昌，2014.

信息之窗

農(nóng)業(yè)部組織開展H7N9流感防控督查

當前，正值H7N9流感高發(fā)季節(jié)，全國防控工作進入關鍵時期。為進一步加強H7N9防控工作，根據(jù)全國動物H7N9流感防控工作視頻會議安排，近期，農(nóng)業(yè)部將派出定點聯(lián)系工作組，赴重點省份開展H7N9防控工作集中督查，督促各地切實落實各項防控措施。(本刊輯)

1004-2342（2014）06-0011-03

S852.65+9.6

B

2014-09-26）

2012年江西省大學生創(chuàng)新訓練項目（DC201313）；南昌市科技支撐項目（201-KJZC-NY-002）

王蓓，女，江西農(nóng)業(yè)大學動醫(yī)專業(yè)學生，E-mail：1106269656@qq.com

*通訊作者：鄔向東，副教授，E-mail：dxywxd2006@126. com。