豬瘟活疫苗外源病毒BVDV細胞培養(yǎng)與PCR檢測的比較

尚宏華 郭建平 謝秋梅

（中牧股份江西生物藥廠，江西 南昌 330200）

豬瘟活疫苗外源病毒BVDV細胞培養(yǎng)與PCR檢測的比較

尚宏華 郭建平 謝秋梅

（中牧股份江西生物藥廠，江西 南昌 330200）

采用細胞培養(yǎng)法和PCR方法，一次性對中股份江西生物藥廠生產(chǎn)的18批豬瘟活疫苗（細胞源）進行了外源病毒BVDV(牛病毒性腹瀉病毒)兩種方法的檢測，并進行了比較。結(jié)果顯示：細胞檢驗外源病毒方法除了能用熒光抗體檢測BVDV外，還能通過致細胞病變檢查和紅細胞吸附試驗檢測藍舌病毒、細小病毒等其它外源病毒；而PCR方法檢測的是病毒核酸，并不能鑒別病毒活性，另外，由于PCR靈敏度高，容易出現(xiàn)假陽性，如果不對DNA測序，可能出現(xiàn)假陽性而導(dǎo)致結(jié)果誤判，給生產(chǎn)企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

豬瘟活疫苗；外源病毒；PCR檢測；比較

為了保證病毒性生物制品安全有效，任何一種生物制品都不允許存在與產(chǎn)品無關(guān)的外源病毒。如果病毒性生物制品攜帶外源病毒，不僅不能有效預(yù)防疾病，甚至還可能成為傳播動物疫病的媒介，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。對于豬瘟活疫苗外源病毒檢驗，其檢驗標準已在《中華人民共和國獸藥典》（2010年版三部）中有明確的規(guī)定。法定的豬瘟活疫苗外源病毒檢驗是通過細胞培養(yǎng)后進行熒光抗體檢查、致細胞病變檢查和紅細胞吸附試驗來判定有無外源病毒污染[1]。但隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，許多生物制品生產(chǎn)企業(yè)、高等院校、研究所、大型養(yǎng)殖場常用PCR檢測生物制品外源病毒污染情況。本文采用細胞培養(yǎng)法和PCR方法，一次性對本廠生產(chǎn)的18批豬瘟活疫苗（細胞源）進行了BVDV外源病毒兩種方法的檢測，并進行了比較。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1綠猴腎（Vero）傳代細胞、PK-15傳代細胞、MDBK傳代細胞。

1.1.2連續(xù)18個批號的豬瘟活疫苗（細胞源）。

1.1.3主要試劑、儀器。DMEM培養(yǎng)液（（GIBCO））、新生胎牛血清（GIBCO）、BVDV間接免疫熒光檢測試劑盒（中監(jiān)所）、BVDV陽性毒株Oregonc24v（中監(jiān)所）、豚鼠紅細胞、雞紅細胞、吉姆薩染色液（Sigma）、倒置熒光顯微鏡（日本Olypus），5%CO2細胞培養(yǎng)箱（SANYO）。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（TIANGEN）、一步法RT-PCR試劑盒（TIANGEN）、PCR儀（美國ABI）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)法檢驗BVDV參照《中華人民共和國獸藥典》（2010年版三部）外源病毒檢驗方法[2]。

1.2.1.1樣品處理。每批疫苗樣品取3瓶，用DMEM液按要求稀釋成每毫升10頭份，混勻、混合離心，取上清液作為被檢樣品。

1.2.1.2樣品的接種、培養(yǎng)與檢驗。接種1mL已處理被檢樣品至長成良好單層的Vero、PK-15、MDBK細胞，另各設(shè)一瓶正常細胞對照，細胞培養(yǎng)5d、10d后反復(fù)凍融細胞3次，連續(xù)繼代2次。培養(yǎng)期間觀察細胞病變情況，最后一次繼代的細胞用熒光抗體檢查法、致細胞病變檢查和紅細胞吸附試驗進行外源病毒檢驗。

1.2.2外源病毒BVDV PCR檢驗是由上海獸醫(yī)研究所提供引物，該廠檢驗人員建立的BVDV檢驗方法。

1.2.2.1取豬瘟活疫苗3瓶，生理鹽水稀釋后混合、混勻。按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明提取病毒RNA。

1.2.2.2按照一步法RT-PCR試劑盒說明，進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，另設(shè)陰陽性對照。

1.2.2.3電泳、拍照。

2 結(jié)果

2.1外源病毒BVDV細胞檢測結(jié)果

Vero、PK-15、MDBK細胞在接種豬瘟活疫苗后連續(xù)繼代2次，均無細胞病變。最后一次繼代后的MDBK細胞用BVDV間接免疫熒光試劑盒染色、鏡檢，結(jié)果除BVDV陽性對照出現(xiàn)特異性熒光外，所有檢測樣品均無出現(xiàn)BVDV特異性熒光，Vero、PK-15細胞分別進行致細胞病變和紅細胞吸附試驗，結(jié)果均無細胞病變和紅細胞吸附現(xiàn)象。圖1、2、3、4、5、6分別為部分樣品熒光染色、致細胞病變和紅細胞吸附圖片。

圖1 BVDV陽性對照熒光染色（100ⅹ）

圖2 接種疫苗樣品熒光染色（100ⅹ）

圖3 正常PK細胞致細胞病變（200ⅹ）

圖4 接種疫苗樣品致細胞病變（200ⅹ）

圖5 正常PK細胞紅細胞吸附（200ⅹ）

圖6 接種疫苗樣品紅細胞吸附（200ⅹ）

2.2外源病毒BVDV PCR檢測結(jié)果（如圖7）

圖7 21:DNAMarker（DL2000）；20:BVDV陽性對照；19：陰性對照；1～18：豬瘟疫苗樣品

被檢疫苗樣品除7、16號樣品和陽性對照出現(xiàn)309bp目的條帶，其它樣品及陰性對照均未檢測到BVDV。同時將18批疫苗接種MDBK細胞，連續(xù)繼代2次，收集BVDV熒光染色時的MDBK細胞培養(yǎng)物進行了BVDV的PCR擴增，結(jié)果18個樣品均為陰性。

2.3所有樣品檢驗結(jié)果見表1。

表1 各樣品外源病毒BVDV不同檢測方法結(jié)果比較

3 討論與分析

在疫苗生產(chǎn)過程中，外源病毒污染主要通過種毒、細胞、血清、胰酶等生物活性材料以及操作人員、容器、設(shè)備。各批疫苗生產(chǎn)之前，所有活性材料都采用細胞培養(yǎng)法并結(jié)合PCR檢測方法對外源病毒進行監(jiān)控，無論是細胞檢驗法還是PCR檢測陽性的原材料，都將嚴格按照GMP要求進行報廢處理，從源頭上切斷了外源病毒對疫苗的污染。整個生產(chǎn)過程嚴格按照GMP要求進行生產(chǎn)，工藝成熟而穩(wěn)定，減少了人為的操作污染。

在進行豬瘟活疫苗外源病毒檢驗時，一次性對該廠生產(chǎn)的連續(xù)18個批號的豬瘟活疫苗外源病毒BVDV進行了細胞檢測和PCR檢測，結(jié)果顯示，細胞檢驗外源病毒方法除了能檢測BVDV外，還能檢測到其它的藍舌病毒、細小病毒等外源病毒。18個疫苗樣品接種Vero、PK-15和MDBK細胞后連續(xù)繼代2次，通過熒光抗體檢查、致細胞病變檢查和紅細胞吸附試驗，結(jié)果均無外源病毒污染。而PCR檢驗結(jié)果有2個樣品為BVDV陽性，為進一步驗證檢驗結(jié)果，將疫苗接種細胞連續(xù)繼代2次后的MDBK細胞培養(yǎng)物也進行了BVDV PCR擴增，結(jié)果均為陰性。出現(xiàn)這種結(jié)果，可能有兩種原因，一是疫苗產(chǎn)品中可能存在BVDV病毒核酸，但并不是活病毒，另一種可能是由于PCR靈敏度高而出現(xiàn)的假陽性，理論上這兩種可能都會導(dǎo)致疫苗直接PCR檢驗出現(xiàn)陽性結(jié)果，而經(jīng)過敏感細胞幾代培養(yǎng)后PCR檢測出現(xiàn)陰性結(jié)果。

近年來，隨著PCR技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，許多研究人員已經(jīng)將PCR技術(shù)應(yīng)用于BVDV的檢測，并且取得了一定的成效。但PCR方法從樣品RNA提取、反轉(zhuǎn)錄到PCR擴增及電泳檢測，全部過程對環(huán)境要求嚴格，操作要求細致，否則由于PCR具有高靈敏度容易出現(xiàn)高陽性率，如果對陽性結(jié)果不做基因測序，經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果偏差。另外，PCR方法的確能快速幫助初步判定產(chǎn)品有無特異性外源病毒污染，但因該法檢驗的是病毒核酸，并不能鑒別病毒活性，需要對基因進行測序，并采用細胞法檢驗其活性，這是PCR檢驗生物制品外源病毒存在的局限性。在實際檢驗工作中，要嚴格貫徹執(zhí)行2010年版《中國獸藥典》外源病毒檢驗法來判定有無外源病毒污染，PCR檢驗只能作為生物制品外源病毒的一種輔助檢驗手段。

[1]中華人民共和國獸藥典[M].2010(第三部).北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：附錄40～42.

[2]中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察室.非禽源活疫苗外源病毒檢驗技術(shù)[Z].北京：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2013.

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