腫瘤靶向多肽生物淘選技術(shù)研究進(jìn)展

郝葆青, 車晨, 李涵依

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041)

腫瘤靶向多肽生物淘選技術(shù)研究進(jìn)展

郝葆青, 車晨, 李涵依

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041)

生物淘選腫瘤或癌細(xì)胞的各種特異性靶向多肽是探索腫瘤早期診斷和治療方法的有效途徑. 特異性靶向多肽既可用于探測(cè)腫瘤細(xì)胞表型特征, 又可將其與抗癌藥物結(jié)合進(jìn)行靶向治療, 同時(shí)還可作為體內(nèi)腫瘤的成像制劑, 用于腫瘤及腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移的早期探測(cè). 噬菌體展示肽庫技術(shù)能夠有效地進(jìn)行生物淘選或識(shí)別出與癌或腫瘤細(xì)胞某一靶點(diǎn)連結(jié)的, 具有特異性、高親和性的多肽. 近年來, 利用體內(nèi)或體外噬菌體展示肽庫技術(shù)已成功地淘選或識(shí)別出一些癌細(xì)胞的靶向多肽. 本文就這些方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了簡要闡述, 重點(diǎn)介紹了癌或腫瘤細(xì)胞靶向多肽的體外和體內(nèi)生物淘選最新技術(shù)和臨床應(yīng)用.

靶向多肽; 噬菌體展示肽庫; 體外(內(nèi))淘選; 癌癥細(xì)胞; 腫瘤

1 引言

調(diào)控或腫瘤細(xì)胞的異常分化、腫瘤藥物的有效轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的發(fā)現(xiàn)是探索新型癌癥或腫瘤防治方法的主要途徑[1]. 利用肽庫技術(shù)篩選一些與腫瘤特異連接的多肽是目前癌癥診療中最具有潛力的方法之一. 一方面, 這些特異性多肽不僅可作為辨別腫瘤細(xì)胞的表型和親和性的配體, 提高對(duì)腫瘤分子診斷的敏感性, 又可用于連接抗癌藥物進(jìn)行靶向治療, 而不損傷其他健康組織; 另一方面, 這些特異性多肽還可作為體內(nèi)腫瘤成像劑, 用于早期癌細(xì)胞及其腫瘤組織微轉(zhuǎn)移的探測(cè). 不過, 如何鑒別這些與癌癥或腫瘤細(xì)胞表面連結(jié)的特異性多肽仍然是臨床靶向藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、傳送、分子成像等應(yīng)用的主要瓶頸.

細(xì)胞表面存在多種大分子, 使得每一類細(xì)胞都會(huì)具有獨(dú)特外貌輪廓或表面地貌結(jié)構(gòu), 這些獨(dú)特的地貌結(jié)構(gòu)常是一些生物分子的遞送地址或靶位. 癌癥細(xì)胞由于遺傳變異和環(huán)境因素的影響或改變了其蛋白組結(jié)構(gòu)、受體類型、數(shù)量和排布方式, 因而細(xì)胞表面呈現(xiàn)出獨(dú)特地貌結(jié)構(gòu)[2]. 靶向治療、體外和體內(nèi)分子診斷都需要篩選出能分辨細(xì)胞及細(xì)胞間表面地貌結(jié)構(gòu)細(xì)微差別的一些高特異性、親和性的配體. 這種情況下, 除了掌握各類型靶細(xì)胞膜蛋白受體的大分子信息外, 還應(yīng)該熟知某一類蛋白受體在不同類型細(xì)胞上的表達(dá)水平. 一段時(shí)間以來, 這些可用作診斷、預(yù)后和(或)藥物靶點(diǎn)生物標(biāo)記的蛋白, 其識(shí)別方法通常都只采用蛋白組學(xué)方法[3]. 比如, 利用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)來比較癌癥和對(duì)照樣品之間蛋白的差別, 再采用質(zhì)譜(MS)法鑒別不同蛋白表達(dá)水平. 盡管2D-PAGE/MS方法很有效, 但是在檢測(cè)含量低或某些類別蛋白時(shí)存在局限性, 尤其是膜蛋白. 因而這類方法通常被認(rèn)為不適用于診斷靶向藥物傳遞的特異細(xì)胞表面蛋白表達(dá)的識(shí)別[4].

癌癥或腫瘤治療和診斷領(lǐng)域中, 許多有成就的發(fā)現(xiàn)大都集中在單克隆抗體研發(fā)方面, 并已相繼研制出一些具有治療性的臨床癌癥單克隆抗體[5]. 單克隆抗體作為遞送載體表現(xiàn)出極高的親和性及特異性, 不過同樣也存在著一些局限性. 免疫抗體復(fù)合物的體積較大, 很難滲透進(jìn)入腫瘤組織[5]. 抗體同毒素或放射性同位素結(jié)合后易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特異性吸收, 易導(dǎo)致肝毒性和骨髓毒性的發(fā)生. 抗體在體內(nèi)的半衰期與PET成像術(shù)采用的普通放射性同位素的半衰期不太匹配, 檢測(cè)腫瘤時(shí)對(duì)比度很差, 通常不能用作分子成像劑[5]. 此外, 抗體大分子下游工程本身的化學(xué)修飾也具有極大的挑戰(zhàn)性. 針對(duì)抗體的這些局限性, 現(xiàn)多傾向于采用多肽作為靶向配體. 多

肽擁有許多優(yōu)勢(shì), 例如相比抗體型配體其體積較小, 可按某一特性大量合成, 或者按某一衍生物特性來進(jìn)行處理加工[6]. 多肽通常可避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吸收, 且對(duì)蛋白受體有較高的親和性, 因此是理想的靶向配體. Schally等研究表明[7], 多肽通過選擇性修飾可增加其在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定性; 他們認(rèn)為一些已知的腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的、且能夠與細(xì)胞表面受體連結(jié)的肽基配體?？捎米靼邢蛞蜃?

噬菌體展示肽庫技術(shù)使與靶蛋白相連接的、可作為靶向多肽配體的篩選成為可能, 尤其是篩選出那些自然存在或還未被發(fā)現(xiàn)的、并可用作生物標(biāo)記的多肽配體[8]. 相關(guān)多肽的篩選和識(shí)別必將在癌癥或腫瘤研究中扮演越來越重要的作用. 本文針對(duì)近年來腫瘤靶向多肽的體外或體內(nèi)淘選的噬菌體展示肽庫技術(shù)的研究進(jìn)展作了較簡要介紹, 重點(diǎn)討論了腫瘤靶向多肽不同淘選方法的特點(diǎn)、臨床應(yīng)用前景及展望.

2 腫瘤靶向多肽生物淘選

圖1 腫等瘤：靶川向西多獐肽牙的菜噬多菌糖體的展提示取肽及庫含淘量選測(cè)示定意圖Fig.1 the abrtidged general view of phage display peptide technology for biopainning of tumor targeting peptides.

在圖1中, 培養(yǎng)的癌細(xì)胞(a)或動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤(b)都可用作為生物淘選的靶目標(biāo). 對(duì)噬菌體的擴(kuò)增進(jìn)行洗脫可作為連結(jié)細(xì)胞表面的噬菌體克隆富集. 來自細(xì)胞裂解物的噬菌體擴(kuò)增則作為連結(jié)在細(xì)胞上的介導(dǎo)細(xì)胞吸收的多肽富集.

1996年, Pasqalini等[9]首先使用噬菌體展示肽庫從動(dòng)物體內(nèi)淘選分離出了能識(shí)別或回訪該動(dòng)物特異器官血管的多肽. 同年, Johnston等[10]發(fā)現(xiàn)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行生物淘選也可獲得能與該類靶細(xì)胞結(jié)合并可引起該靶細(xì)胞內(nèi)吞作用的多肽. 他們實(shí)驗(yàn)共同特點(diǎn)是所淘選出的短肽對(duì)其來源的靶細(xì)胞類型識(shí)別的特異性遠(yuǎn)高于對(duì)其他類型細(xì)胞. 并且, 重要的是這些淘選方法消除了先前需對(duì)其細(xì)胞靶蛋白進(jìn)行鑒別和純化的憂慮[11]. 此外, 所淘選的短肽通?？勺鳛榧?xì)胞自身的成分并與它們的靶點(diǎn)連接. 不過, 他們的實(shí)驗(yàn)都只是針對(duì)異源性靶點(diǎn)的非偏差篩選, 而不是用于靶向治療的各類細(xì)胞受體純化蛋白連接多肽的淘選. 現(xiàn)在觀點(diǎn)認(rèn)為這些方法在理論上仍可用于針對(duì)腫瘤特異性靶向配體的淘選[11]. 腫瘤細(xì)胞的生物淘選常可分為全細(xì)胞淘選(體外生物淘選)和體內(nèi)生物淘選兩類, 其中全細(xì)胞篩選又包括有固相全細(xì)胞篩選、液相全細(xì)胞篩選. 這兩類淘選方法都具有各自特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)和不足.

2.1 腫瘤細(xì)胞的全細(xì)胞淘選

全細(xì)胞淘選(也常稱體外生物淘選), 噬菌體肽庫展示方法之一, 用于分離與細(xì)胞特定靶點(diǎn)連接的多肽, 也就是將培養(yǎng)的完整細(xì)胞作為誘餌以達(dá)到分離各種細(xì)胞連接多肽的淘選方法(圖-1-a). 目前, 這種方法在利用不同噬菌體展示肽的排列識(shí)別某種細(xì)胞類型的細(xì)胞連接配體方面已經(jīng)取得了非常大的成功, 盡管在淘選過程中存在靶點(diǎn)異源性. 目前, 該方法已被拓展為各種純化蛋白的多肽配體的識(shí)別技術(shù)[12]. 要淘選分離出或獲取與細(xì)胞表面連接的、或是既可與細(xì)胞連接又能引發(fā)細(xì)胞吸收的多肽配體, 主要取決于配體下游應(yīng)用的需要. 經(jīng)體外生物淘選的多肽都有一個(gè)特殊的特征, 那就是細(xì)胞特異性, 即不同于與它們來源的或相近的細(xì)胞類型的細(xì)胞相連接[13].簡單而言, 體外淘選的方法就是將短肽隨機(jī)組成的噬菌體肽庫與有興趣研究的細(xì)胞進(jìn)行孵育, 孵育后進(jìn)行一系

列嚴(yán)格清洗以去除未連接或連接不牢的噬菌體. 為了獲取結(jié)合有細(xì)胞表面片段(多肽)的噬菌體, 一定強(qiáng)度的洗脫程序是必需的. 然后用這些連接有多肽片段的噬菌體去感染大腸桿菌后就可完成噬菌體的回收和擴(kuò)增. 以上幾步稱為一輪淘選, 大概需要經(jīng)歷4-6輪. 實(shí)際上, 評(píng)判整個(gè)淘選結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)被設(shè)定為與細(xì)胞一起孵育的噬菌體總數(shù)和與細(xì)胞連接的噬菌體總數(shù)的比值不再增加或是保持相對(duì)穩(wěn)定為止. 噬菌體對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有趨向性,由肽庫擴(kuò)增的噬菌體既可牢固地與細(xì)胞表面連接又可促使細(xì)胞內(nèi)在的消化吸收[14]. 由于肽庫中任一噬菌體的唯一的、獨(dú)特的組分就是所展示的多肽, 因此這個(gè)多肽就成為噬菌體是否與一特定細(xì)胞類型連接的決定因素.

全細(xì)胞多肽淘選有如下優(yōu)勢(shì):首先, 能保持細(xì)胞受體的天然屬性. 細(xì)胞外表地貌是由膜結(jié)合蛋白的表達(dá)水平以及在膜中的排列情況所決定, 這不是純化的膜蛋白所能模仿的. 其次, 通過洗滌條件的改變可使淘選出偏重于可介導(dǎo)細(xì)胞吸收的短肽, 因?yàn)樵谔赃x純化后的膜蛋白時(shí), 其過程僅由連接特性來驅(qū)動(dòng). 第三, 在對(duì)所淘選的特定大分子沒有選擇要求的情況下,此種方法是一種隨機(jī)的淘選方式,換言之就是不需要了解細(xì)胞受體前期情況[15].因此, 某類型細(xì)胞靶向多肽的生物淘選無需了解其細(xì)胞外表結(jié)構(gòu)形態(tài); 研究人員可通過淘選去發(fā)現(xiàn)那些還未被考慮的、或有望成為靶點(diǎn)的或者是還未被識(shí)別的細(xì)胞表面大分子[15].

目前采用全細(xì)胞淘選方法已經(jīng)分離出了許多癌癥特異性多肽[15]. 但這些多肽序列之間幾乎沒有相似性, 這很可能是肽庫設(shè)計(jì)、細(xì)胞株和淘選方案上的不同所致. 現(xiàn)采用的肽庫有線性和環(huán)狀, 多肽長度多為6至20個(gè)氨基酸, 大多可以直接用于各種新鮮細(xì)胞株的多肽生物淘選. 2008年Kubo等報(bào)道, 對(duì)使用捕獲顯微激光切割分離法得到的人類結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行的生物淘選獲得了成功[16]. 全細(xì)胞淘選方法突顯了體系穩(wěn)固性和細(xì)胞誘餌屬性的靈活性, 淘選出的多肽能特異回訪作為誘餌的細(xì)胞. 另外, 該方法也可用于腫瘤基質(zhì)中的一些蛋白生物學(xué)混合物的淘選. 2006年P(guān)ilch等[17]報(bào)道, 針對(duì)腫瘤胞外基質(zhì)中富含凝血纖維的結(jié)合素可滲透進(jìn)腫瘤間隙空間從而產(chǎn)生纖維蛋白這一現(xiàn)象, 他們將血漿凝塊作為靶點(diǎn)進(jìn)行生物淘選, 分離后得到可與纖維蛋白-纖鏈結(jié)合蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)合的兩個(gè)環(huán)狀多肽. 這兩個(gè)多肽通常聚集在動(dòng)物異種移植的乳腺癌(MDA-MB-435)細(xì)胞間隙中, 并且能與乳腺癌臨床樣本的冷凍切片組織相連接.

需要進(jìn)行多輪的體外淘選, 直至幾個(gè)“最好”或占優(yōu)勢(shì)(由親和性來確定)的多肽序列被淘選出. 另外, 如果想要實(shí)現(xiàn)藥物或基因轉(zhuǎn)送等方面的應(yīng)用還需考慮所淘選分離的多肽能否被介導(dǎo)細(xì)胞所吸收. 對(duì)于多數(shù)細(xì)胞株或患者樣本的篩選, 也可在淘選過程中通過使用大規(guī)模測(cè)序方法來盡早鑒別出這些符合要求的短肽序列[18]. 即使這些合意短肽由于不具有高度的親和性而不能用作細(xì)胞靶向配體, 但它們?nèi)钥捎糜趯?shí)驗(yàn)細(xì)胞株表面相似物的鑒別,而且它們能提供某類疾病異質(zhì)性的信息, 以便了解不同器官所產(chǎn)生的癌細(xì)胞之間的相似性.

2.2 腫瘤靶向短肽體內(nèi)淘選

體內(nèi)淘選多基于肽庫噬菌體能夠定向的識(shí)別靶器官的分離這一特性. 一般來說就是將肽庫噬菌體注入小鼠尾部靜脈, 在體內(nèi)短暫孵育后, 處死小鼠取出靶向器官, 然后將靶器官的噬菌體回收后在均質(zhì)組織中進(jìn)行擴(kuò)增,再將其注入到另一只小鼠體內(nèi)進(jìn)行下一輪重復(fù)淘選過程(圖-1-b). 3-5輪淘選后, 幾個(gè)靶器官的短肽序列即可被鑒定出來[19]. 由于體內(nèi)淘選方法取決于回收感染噬菌體的能力, 因此體內(nèi)循環(huán)時(shí)間通常選擇在5到15分鐘的范圍內(nèi). 就因?yàn)檫@個(gè)原因, 盡管研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)個(gè)別短肽可滲進(jìn)腫瘤組織, 體內(nèi)淘選還是通常只涉及到以血管器官為靶點(diǎn)的短肽識(shí)別. 另外, 此種淘選方法不管受到何種生物學(xué)限制, 比如動(dòng)物內(nèi)在的血清穩(wěn)定性、細(xì)胞途徑和清除率等, 體內(nèi)淘選應(yīng)確保所分離的多肽必須能回訪動(dòng)物體內(nèi)的靶點(diǎn). 體內(nèi)淘選通常需要體外淘選來協(xié)作進(jìn)行,即在體內(nèi)淘選前可先進(jìn)行體外淘選以富集可能的候選肽, 其后再將這些多肽注入進(jìn)行體內(nèi)淘選. 有文獻(xiàn)報(bào)道,并且國內(nèi)已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)噬菌體肽庫篩選的次數(shù)越多, 就越能夠獲得具有高度親和性的噬菌體展示肽. 以此為基礎(chǔ)進(jìn)行多次體內(nèi)或體外淘選, 噬菌體的富集率將會(huì)逐漸提. Laakkonen等將體內(nèi)淘選和體外淘相選結(jié)合分離出了一種與腫瘤淋巴管相結(jié)合、而不是同脈管系統(tǒng)結(jié)合的多肽[20]. 腫瘤淋巴管能為腫瘤細(xì)胞提供從原發(fā)瘤擴(kuò)散的途徑, 如果這些靶向多肽破壞了這些淋巴管, 也就達(dá)到了抑制腫瘤的潛在性轉(zhuǎn)移目的.

不同類型的腫瘤可分離得到不同的多肽, 即使采用相同的肽庫, 不同的腫瘤類型也會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞的受體外形. 2003年Hoffman等報(bào)道, 他們分離出了可區(qū)分發(fā)育不健全的皮膚新生血管與繼發(fā)腫瘤中的新生血管的多肽[21]. 說明多肽的辨別力是相當(dāng)精確的, 同時(shí)這些多肽也是具有特異性的. 2004年, Laakkonen等采用生物淘選法分離出可與乳腺癌、前列腺癌和骨肉瘤中淋巴管接合的高度特異性環(huán)狀9肽(LyP-1)[22]. 該肽不會(huì)回訪黑素瘤

和血癌異種移植物, 由此顯示出該肽僅對(duì)腫瘤上的淋巴標(biāo)記物表現(xiàn)出特異性. 同時(shí), 他們證實(shí)了該肽不會(huì)與小鼠腫瘤的脈管系統(tǒng)或其他組織相接合. 該肽一旦與淋巴標(biāo)記物特異性接合時(shí), 其就會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的位臵. 2006年, Zhang等報(bào)道說所淘選分離的一些短肽能區(qū)分在惡化前受到損傷部分的淋巴管和一個(gè)前列腺癌TRAMP動(dòng)物模型中惡化的腫瘤[23]. 2008年Han等鑒別出了一種能與腫瘤相結(jié)合的短肽, 這種短肽在與非應(yīng)答腫瘤接合時(shí)會(huì)對(duì)放射治療結(jié)合的、VEGF受體絡(luò)氨酸激酶的抑制劑(SU11248)產(chǎn)生了敏感性[24].

相同肽庫和(或)相同細(xì)胞株, 生物淘選(體外和體內(nèi))方法不同所分離的短肽也不盡相同. 利用十二肽庫和非小細(xì)胞肺癌CL1-5細(xì)胞株進(jìn)行體外淘選, 分離得到的短肽為TDSILRSYDWTY(SP5-2); 用同樣的肽庫和腫瘤異種皮移植物的CL1-5細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)淘選, 分離得到的短肽為SVSVGMKPSPRP(SP5-52)[25,26]. 進(jìn)一步研究證實(shí), SP5-52是以器官的血管為靶點(diǎn), 而SP5-2則滲透進(jìn)入腫瘤形成分散貫穿腫瘤團(tuán)塊的連接形式. 因此, 這兩種生物淘選方法各自強(qiáng)調(diào)靶點(diǎn)的不同分子特征. 淘選小鼠內(nèi)皮產(chǎn)生的血管瘤, 如果所分離得到的多肽不能跨越物種差異, 那么這些多肽也許不會(huì)轉(zhuǎn)化到人類的血管系統(tǒng)中. 為了克服這種局限性, 需鑒別短肽的細(xì)胞靶向性并確定人類血管瘤是否有相同類似物的表達(dá); 或者是將分離出的短肽序列作為與人體中配對(duì)物連結(jié)的最佳突變起始點(diǎn);或是直接在人體中進(jìn)行生物淘選. Arap等[27]首次嘗試了將肽庫噬菌體注入到一位晚期患者體內(nèi), 并從其組織中回收噬菌體. 經(jīng)過大量精確的測(cè)序鑒別出了能分離不同血管器官的不同三肽模體. Krag等[28]也報(bào)道說, 他們對(duì)患者進(jìn)行了一系列的淘選/活體組織檢測(cè). 盡管在人體內(nèi)進(jìn)行生物淘選的前景無限, 但到目前為止仍未淘選出能夠應(yīng)用于臨床的高親和性腫瘤靶向因子.

2.3 腫瘤靶向多肽的研究現(xiàn)狀

靶向治療在腫瘤治療過程中通俗來講就是針對(duì)某種癌細(xì)胞, 或者是癌細(xì)胞的某一個(gè)蛋白, 某一個(gè)分子進(jìn)行治療. 其分為三種類型, 第一種是針對(duì)某個(gè)器官, 叫器官靶向; 第二種叫細(xì)胞靶向, 針對(duì)某種類型的腫瘤細(xì)胞;第三種是分子靶向, 其是針對(duì)的是. 腫瘤細(xì)胞內(nèi)某一蛋白家族的某部分分子, 或是某一核苷酸片段, 亦或是某個(gè)基因的產(chǎn)物. 其中分子靶向治療的特異性最高, 其分辨出腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞表面地貌的差異, 只攻擊腫瘤細(xì)胞, 對(duì)正常的細(xì)胞沒有太大的影響.

分子靶向治療常用的載體之一便是靶向性多肽, 另一種載體為單克隆抗體. 針對(duì)腫瘤抗原設(shè)計(jì)相應(yīng)的單克隆抗體, 由于其開發(fā)過程更快捷, 具有較高的特異性以及誘導(dǎo)針對(duì)疾病的免疫能力, 是目前腫瘤導(dǎo)向治療中最常用的載體. 但其種類非常有限, 并因體積較大, 滲透力較差及對(duì)肝臟骨髓的毒性作用等原因, 在實(shí)際操作過程中仍存在不便. 尋找新的分子靶點(diǎn), 提高單抗導(dǎo)向的特異性, 實(shí)驗(yàn)單抗人源化, 是進(jìn)一步研究的重點(diǎn).

靶向性多肽是當(dāng)前普遍認(rèn)為的比較理想的腫瘤診斷和靶向性治療載體. 它們具有高特異性、高親和性、良好的組織滲透性, 能被腫瘤細(xì)胞所攝取, 易于化學(xué)合成并有較低的免疫原性, 同單克隆抗體相比擁有更多的優(yōu)勢(shì). 近年來, 國內(nèi)外的研究人員利用肽庫技術(shù)針對(duì)不同的靶點(diǎn)進(jìn)行不同的腫瘤靶向肽篩選, 例如Arap等對(duì)乳腺癌荷瘤小鼠進(jìn)行肽庫篩選后獲得了一系類與腫瘤血管特異性結(jié)合的短肽, 其中的RGD序列被證實(shí)可與α整合素結(jié)合, 可特異性靶向多種惡性腫瘤.

噬菌體展示肽庫技術(shù)在多種把向腫瘤多肽配體研究中發(fā)揮了重要作用, 目前有研究報(bào)道:在體外已成功篩選出針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞如肺癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞以及急性髓性白血病細(xì)胞等特異性結(jié)合肽, 這在腫瘤的診斷、靶向治療等方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值.

目前, 醫(yī)治腫瘤的傳統(tǒng)治療模式如手術(shù)、放療、化療仍然是治療腫瘤的主要手段. 隨著生物學(xué)研究對(duì)腫瘤靶向肽配體的不斷探索, 腫瘤靶向治療因其較低的不良反應(yīng)及良好的療效, 能夠明顯提高患者的生活質(zhì)量, 代表著腫瘤治療的未來趨勢(shì), 將來的腫瘤治療模式將是以分子生物學(xué)診斷為基礎(chǔ)的綜合性靶向治療30. 噬菌體肽庫展示技術(shù)以活細(xì)胞為靶目標(biāo)篩選噬菌體肽庫, 尋找特異性及高親和性的生物活性肽, 為蛋白質(zhì)分子相互識(shí)別的研究、新型疫苗的研制以及藥物的開發(fā)開拓了新的前景.

雖然針對(duì)腫瘤分子的靶向治療的研究仍是前沿研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一, 但是到目前為止, 大部分靶向治療的臨床研究都不盡如人意, 研究人員在進(jìn)行真正的臨床治療方面仍存在較大障礙. 原因之一是載體不能特異性的針對(duì)腫瘤細(xì)胞, 另一個(gè)原因是治療基因沒有在腫瘤細(xì)胞內(nèi)很好的表達(dá), 其結(jié)果是無法完全消滅腫瘤; 靶向藥物在經(jīng)過靜脈到達(dá)腫瘤組織時(shí)藥物不斷降解、稀釋乃至失活或者與正常的細(xì)胞或組織非特異性結(jié)合等等這些都嚴(yán)

重影響治療的效果.

3 挑戰(zhàn)與展望

噬菌體展示技術(shù)在淘選分離腫瘤靶向肽配體方面獲得了一些成功, 但仍然存在巨大挑戰(zhàn). 主要的挑戰(zhàn)就是所淘選各種多肽的細(xì)胞靶向性識(shí)別, 因?yàn)橐延械亩嚯呐潴w受體只鑒定出15%. 雖然淘選分離的短肽在細(xì)胞受體未知情況下仍可用于藥物靶向傳送, 但優(yōu)先考慮靶點(diǎn)受體的鑒別主要基于以下幾個(gè)理由:第一, 受體識(shí)別能夠提供癌病變、腫瘤維持以及轉(zhuǎn)移期間的細(xì)胞表面輪廓變化信息. 這可為疾病中新受體作用的基礎(chǔ)研究打開通道. 第二, 受體一旦識(shí)別, 即可產(chǎn)生受體的新配體. 肽配體在某一些應(yīng)用中也許更具有適用性, 而在其他方面, 抗體、類肽或小分子活血是更好的選擇. 第三, 深刻理解配體相應(yīng)受體屬性將有助于加快肽配體臨床應(yīng)用的進(jìn)程.

生物細(xì)胞表面具有蛋白與微域內(nèi)的各種連接片段或簇發(fā)生多聚化的地貌結(jié)構(gòu), 這種外貌地形同時(shí)也賦予了肽配體的特異性. 換言之, 肽配體特異性不僅由受體蛋白表達(dá)水平所產(chǎn)生, 同時(shí)也取決于細(xì)胞膜表面受體的排布. 在膜蛋白的親和性純化和制備時(shí), 很容易丟失受體蛋白表達(dá)水平的信息, 而且這些信息在mRNA水平中不會(huì)出現(xiàn). 另外, 假設(shè)短肽與蛋白受體相鏈接, 那么這些鏈接多發(fā)生在糖蛋白、糖脂和磷脂的糖部分. Elayadi等[29]報(bào)道他們利用蛋白數(shù)據(jù)庫尋找某個(gè)多肽相似序列的方法時(shí)獲得了幾個(gè)分離短肽的候選受體. 大多數(shù)噬菌體展示肽庫都是化學(xué)合成的, 而并非由生物源產(chǎn)生, 不過完全覆蓋更長的多肽序列是受限制的. 就化學(xué)合成而論, 其短肽序列與生物源序列匹配的概率在靜態(tài)上是較低的. 即使存在較多的匹配, 許多化學(xué)合成的短肽也無法確切了解受體的生物學(xué)特征. 總之, 作為淘選肽配體的受體配對(duì)物的識(shí)別仍需要開發(fā)一些新技術(shù), 具體來說就是需要將細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組和基因組方法相結(jié)合來處理這個(gè)難題.

雖然現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)了噬菌體展示肽庫技術(shù)是獲取癌癥靶向肽配體的重要來源, 但在實(shí)際應(yīng)用癌癥靶向肽配體的過程中仍然有許多困難需要克服. 近年來, 隨著分子生物技術(shù)的蓬蓬勃勃飛發(fā)展, 市場(chǎng)上多肽藥物數(shù)量以及癌癥靶向肽配體的研發(fā)及制藥公司的數(shù)目明顯增加. 這些也都顯示出多肽作為藥物以及藥物載體的障礙正逐漸被消除. 相信在不久的將來, 更多的能夠作為靶向藥物或分子成像探針的多肽亦或是癌癥靶向肽配體將會(huì)投放到臨床實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用中去.

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Advances in the research and development of phage display peptide library technology for biopanning of tumor targeting peptides

HAO Bao-qing, CHE Chen, LI Han-yi
(School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Biopanning tumor-specific or cancer-specific binding peptide as targeting factor is one of the effective methods for earlier diagnosis and treatment of tumor. Tumor-specific binding peptides can be used to probe the tumor cell surface phenotype and customize treatment accordingly by binding to an anticancer drug. Additionally, these targeting peptides can be used as in vivoimaging agents that allow for earlier detection of tumors and micrometastasis. Phage display is a powerful technique for the isolation of peptides that bind to a particular target with high affinity and specificity. The biopanning of intact cancer cells or tumors in animals can be used to isolate peptides that bind to cancer-specific cell surface biomarkers. Over the past 10 years, unbiased biopanning of phage-displayed peptide libraries has generated a suite of cancer targeting peptidic ligands. This review discusses the identification of surface features on cancer or tumor cells and methods of biopanning with phage display peptide technology in vitro and in vivo, and highlights advances in the research and development of screening of cancer or tumor cells targeting peptides as well as the use of the isolated peptides in clinical applications.

phage display peptide library technology; targeting peptide; biopanning in vitro(in vivo); cancer cell; tumor

R318

: A

: 1003-4271(2014)03-0358-06

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.07

2014-02-17

郝葆青(1956-), 男, 漢族, 河北保定人, 教授, 研究方向: 藥物載體. Email: 1296714389@qq.com.