藏藥波棱瓜子總木脂素對刀豆球蛋白(ConA)致免疫性肝損傷小鼠保護作用及其機制探討

顧健, 李佳川, 樊利娜

(西南民族大學化學與環(huán)境保護工程學院, 四川 成都 610041)

【特約專稿】

藏藥波棱瓜子總木脂素對刀豆球蛋白(ConA)致免疫性肝損傷小鼠保護作用及其機制探討

顧健, 李佳川, 樊利娜

(西南民族大學化學與環(huán)境保護工程學院, 四川 成都 610041)

目的:波棱瓜子是常見的用于治療肝病的藏藥, 療效確切. 前期研究表明, 總木脂素是波棱瓜子抗肝損傷的有效部位, 但療效尚不明確. 本研究擬考察藏藥波棱瓜子總木脂素對ConA致小鼠免疫性肝損傷的保護作用, 并進一步探討其對抗肝損傷的作用機制.方法:采用尾靜脈注射一次性ConA(20mg/kg)誘發(fā)小鼠免疫性肝損傷, 造模8h后取血樣和肝臟, 考察不同劑量的波棱瓜子總木脂素對各組小鼠臟器系數(shù)、血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、骨過氧化物酶(MPO)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等生化指標活力或水平的影響; 以HE染色對肝組織進行組織病理學檢查; 免疫組織化學法檢測波棱瓜子總木脂素對各組小鼠肝臟中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)、核轉錄因子-κB(NF-κB)表達的影響.結果:波棱瓜子總木脂素可以降低ConA所致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)及血清ALT、AST、ALP活力, 顯示出較好的保肝作用. 同時波棱瓜子總木脂素也可降低肝損傷小鼠血清NO水平和MPO、NOS活力, 并減少肝組織勻漿中MDA的含量, 增強SOD和GSH-Px活性, 表現(xiàn)出良好的抗氧化作用; 免疫組化結果顯示, 波棱瓜子總木脂素還能抑制諸如TNF-α、IFN-γ、IL-4、NF-κB等促炎癥因子的表達, 促進抗炎癥因子IL-10的表達, 從而抑制肝臟炎癥反應而發(fā)揮其保肝作用. 病理觀察結果也表明, 波棱瓜子總木脂素能減輕ConA對肝組織的損傷.結論: 波棱瓜子總木脂素對ConA致小鼠免疫性肝損傷都具有一定的保護作用,其保肝作用可能與其抗炎、抗氧化能力有關.

波棱瓜子總木脂素; 免疫性肝損傷; 刀豆球蛋白A; 保肝; 抗炎; 抗氧化

研究表明, 以肝細胞炎癥、脂質過氧化、肝功能異常為主要特點的肝臟損傷是各種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎, 一般多由病毒、藥物、毒劑、酒精、缺氧等因素引起. 肝損傷發(fā)病機制頗為復雜, 一般認為有化學性和免疫性兩大類. 前者主要通過細胞色素P450及結合反應產生的中間代謝產物產生損傷, 如改變質膜的完整性、誘導線粒體功能失調、鈣超載誘導細胞凋亡、降解酶的活性及自由基的作用等. 而免疫性肝損傷則主要是通過體內各種細胞因子、一氧化氮、補體及免疫變態(tài)反應等產生損傷. 如在病毒性肝炎中, 乙肝病毒(HBV)可誘導T細胞介導的細胞免疫反應, 并不直接殺傷肝細胞. 而是通過募集免疫效應細胞至感染的肝臟細胞, 分泌各種炎癥、趨化、粘附因子, 一方面可清除入侵的HBV; 另一方面, 上述免疫活性物質可進一步誘導免疫效應細胞釋放出過量的炎癥因子, 造成更為嚴重的炎癥反應, 從而損傷肝細胞[1]. 而通過減少炎癥因子釋放, 抑制粘附分子表達等, 可不同程度減輕肝臟損傷, 為肝損傷的臨床治療提供了一個切實可行的切入點.

流行病學調查表明, 肝損傷是嚴重危害人類健康的疾病臨床常見疾病之一. 而我國是各類肝病的高發(fā)區(qū)域,尤其以HBV感染最為常見. 目前, 針對病毒性肝炎的治療, 現(xiàn)多提倡綜合治療, 雖然可以通過保護肝實質細胞,

減輕肝損傷, 減緩肝功能的衰退, 控制病情, 但尚無確切有效的藥物, 現(xiàn)有的藥物只是治標不治本. 因此, 亟需尋找更為安全有效的藥物對抗肝臟損傷.

藏醫(yī)藥對肝病的治療已經(jīng)引起了國內外學者的關注, 且有望從藏藥材中發(fā)現(xiàn)治療肝炎的藥材或新的先導化合物. 波棱瓜子為葫蘆科波棱瓜Herpetosperalga pedunculosumWal1．的干燥成熟種子, 始載于藏醫(yī)學著作《月王藥診》, 廣泛用于多種藏藥復方制劑, 其味苦, 性寒, 能清腑熱, 膽熱, 具有清熱解毒、去火降熱、助消化作用,用于治療赤巴病, 肝病(肝熱、黃疸型傳染性肝炎), 膽病以及消化不良[2-4]. 目前已報道, 波棱瓜子可用于治療乙型肝炎病毒、化學物質導致的肝損傷及肝癌等疾病. 前期藥效學研究也表明, 波棱瓜子具有較強抗乙肝病毒、保肝降酶活性, 發(fā)現(xiàn)并確定其抗肝炎的有效部位為總木脂素[5-7]. 然而, 波棱瓜子抗肝損傷的作用機理, 尚不十分清楚. 因此, 本研究以藏藥波棱瓜子總木脂素為研究對象, 采用ConA誘導小鼠免疫性肝損傷模型, 選擇肝功能生化指標, 免疫功能觀察指標, 分別從脂質過氧化, 免疫調節(jié)和細胞因子水平方面, 探討波棱瓜子總木脂素對免疫性肝損傷的保護作用及其機制, 以期為波棱瓜子總木脂素在病毒性肝炎等免疫性肝損傷中的應用提供實驗依據(jù). 為逐步確定波棱瓜子治療肝病作用物質基礎, 擴大其臨床應用范圍, 充分開發(fā)利用這一藥用資源奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

波棱瓜子總木脂素, 由西南交通大學生命科學與工程學院提供; 聯(lián)苯雙酯滴丸, 浙江萬邦藥業(yè)有限公司, 批號: 20081107; 復方甘草酸苷片, 日本米諾發(fā)源制藥株式會社, 批號: 12084.

1.2 動物

ICR小鼠, SPF級, 20±2g, 雄性, 動物合格證號: 動物合格證號: SCXK[川]2013-24, 購于成都達碩實驗動物研究中心.

1.3 試劑

刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA), 美國Sigma公司產品; ALT(批號: 2013018)、AST(批號: 2013018)、ALP(批號: 2013003), 均購自長春匯力生物技術有限公司; NO(批號: 20131010)、NOS(批號: 20131010)、MPO(批號: 20131009)、總蛋白(批號: 20131010)、MDA(批號: 20131011)、SOD(批號: 20131010)、GSH-Px(批號: 20131011),均為南京建成生物工程研究所產品; TNF-α(批號: bs-2081R)、IFN-γ(批號: bs-0480R)、IL-4(批號: bs-0581R)、IL-10(批號: bs-6761R), 均購自北京博奧森生物技術有限公司; NF-κB(批號: BA1297), 武漢博世德生物工程有限公司; 生物素化山羊抗兔IgG(批號: 13152A11), 北京中山金橋生物有限公司; 辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素(批號: 13152A11), 北京中衫金橋生物有限公司; 濃縮型DAB顯色試劑盒(批號: K135925C), 北京中衫金橋生物有限公司.

1.4 方法

1.4.1 主要試劑的配制

ConA劑量為20mg/kg, 應用時無菌條件下, 溶于生理鹽水中制成1mg/ml的溶液.

1.4.2 動物分組、給藥、造模

ICR小鼠, 雄性, 20±2g, 80只, 按體質量分層, 隨機分成8組, 空白組、模型組、給藥組(0.375g/kg、0.75g/kg、1.5g/kg、3g/kg)、陽性對照(聯(lián)苯雙酯200mg/kg、復方甘草酸苷片113mg/kg), 各組按實驗設計劑量連續(xù)給藥7d, 末次給藥后1h, 除空白組, 其余各組一次性尾靜脈注射ConA20mg/kg, 誘導免疫性肝損傷[8-11].

1.4.3 檢測指標

尾靜脈注射ConA后, 禁食不禁水8h, 小鼠取樣前稱重, 摘眼球取血后, 立即推頸處死, 解剖取出肝臟, 濾紙擦拭, 稱重, 計算肝臟系數(shù). 肝臟系數(shù)(%)=(肝臟質量mg/體質量g)×100%. 血樣室溫靜臵30min, 4000rpm/min、離心10min, 取上清, 備用. 按說明書分別測定血清ALT、AST、ALP、NO、NOS、MPO. 取上述肝臟組織, 一部分臵于10%福爾馬林溶液固定, 脫水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等, 最后鏡檢; 免疫組化法測定相關炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ、NF-κB、IL-4、IL-10. 陽性表達: 顏色為淺黃色或棕黃色, 陰性表達為藍色, 底色為

白色, 主要表達在細胞漿、細胞膜, 或間質等. 一部分制備成10%肝勻漿, 備用, 測定MDA、SOD、GSH-Px.

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝臟腫脹明顯. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能顯著降低ConA誘導的免疫性肝損傷小鼠升高的肝臟系數(shù)水平(p<0.01). 結果見表1.

表1 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響, n=10)Table 1 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表1 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響, n=10)Table 1 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

等：川西獐牙菜多糖的提取及含量測定組別 劑量/g·kg-1肝臟系數(shù)%空白 - 46.82±2.26**模型 - 62.12±6.19聯(lián)苯雙酯 0.2 52.98±3.44**復方甘草酸苷片 0.113 56.68±3.88**波棱瓜子木脂素0.375 55.64±4.050**0.75 54.73±2.10**1.5 54.82±2.51**3 52.91±1.73**

2.2 對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清AST、ALT、ALP活力的影響

與空白組比較, 模型組小鼠血清中的AST、ALT、ALP活力明顯高于空白組, 表明ConA致免疫性肝損傷模型建立成功. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能降低免疫性肝損傷小鼠血清中的AST、ALT、ALP活力(p<0.05～0.01), 表明波棱瓜子總木脂素能夠降低ConA引起的酶活性升高, 減輕肝臟損傷程度. 結果見表2.

表2 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響(, n=10)Table 2 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum ALT, AST and ALP of immunologic liver injury mice induced by ConA( , n=10)

表2 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響(, n=10)Table 2 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum ALT, AST and ALP of immunologic liver injury mice induced by ConA( , n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1ALT/U·L-1AST/U·L-1ALP/U·L-1空白 - 39.56±2.33**96.82±5.56**122.59±4.18**模型 - 213.1±2.96 218.29±6.70 220.68±34.63聯(lián)苯雙酯 0.2 174.93±13.90**170.18±11.64**149.84±22.39**復方甘草酸苷片 0.113 197.67±8.10*189.35±13.91**153.32±23.66**波棱瓜子木脂素0.375 176.05±21.81**175.94±16.20**118.68±21.37**0.75 147.06±10.21**171.59±13.81**133.10±32.89**1.5 178.61±17.33**164.47±22.90**125.06±19.07**3 163.65±18.42**159.06±23.52**110.90±19.32**

2.3 對肝臟組織病理學的影響

病理檢查結果顯示, 空白組小鼠肝組織結構清晰完整, 未見點狀壞死和炎性細胞浸潤, 肝內未見纖維組織增生及假小葉形成; 模型組小鼠肝組織可見點狀壞死及小灶性壞死, 肝小葉內大多數(shù)肝細胞腫脹, 伴有較多炎性細胞浸潤. 波棱瓜子總木脂素各劑量組、聯(lián)苯雙酯組、復方甘草酸苷片組均有一定程度的肝細胞損害, 輕度灶

性壞死, 濁腫, 與模型組比較, 損傷程度較輕, 炎性細胞浸潤也減少, 提示波棱瓜子總木脂素能夠改善肝臟組織病變, 對免疫性肝損傷小鼠有很好的保護作用. 結果見圖1.

2.4 對小鼠血清NO含量、NOS活力的影響

表3 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清NO、NOS的影響(, n=10)Table 3 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum NO and NOS of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表3 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清NO、NOS的影響(, n=10)Table 3 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the levels of serum NO and NOS of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1NO/umol·L-1NOS/U·ml-1空白 7.99±1.48**18.87±3.04**模型 15.39±1.53 29.98±2.45聯(lián)苯雙酯 0.2 10.35±1.74**23.66±2.08**復方甘草酸苷片 0.113 12.59±1.76*27.99±1.87**波棱瓜子木脂素 0.375 11.53±1.55**22.43±1.95**0.75 10.94±1.57**20.60±2.29**1.5 12.47±1.77**23.94±3.07**3 11.88±1.29**21.84±3.26**

與空白組比較, 模型組小鼠血清NO含量升高, NOS活力增強. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素各劑量組均能降低免疫性肝損傷小鼠升高的血清NO、NOS水平(p<0.05～0.01). 結果見表3.

2.5 對小鼠血清MPO活力的影響

與空白組比較, 模型組小鼠血清中MPO含量顯著升高. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能明顯減輕小鼠血清MPO的含量(p<0.01). 結果見表4.

表4 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清MPO的影響, n=10)Table 4 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of serum MPO of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表4 波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷小鼠血清MPO的影響, n=10)Table 4 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of serum MPO of immunologic liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1MPO/U·L-1空白 219.27±36.22**模型 587.12±71.97聯(lián)苯雙酯 0.2 362.83±90.53**復方甘草酸苷片 0.113 434.61±63.69**波棱瓜子木脂素 0.375 432.65±67.65**0.75 375.61±87.06**1.5 391.35±66.50**3 358.90±85.50**

表5 波棱瓜子總木脂素對ConA致肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH-Px的影響(,n=10)Table 5 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of MDA, SOD and GSH-Px in liver homogenates of liver injury mice induced by ConA(, n=10)

表5 波棱瓜子總木脂素對ConA致肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH-Px的影響(,n=10)Table 5 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the level of MDA, SOD and GSH-Px in liver homogenates of liver injury mice induced by ConA(, n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1MDA/nmol·mgprot-1SOD/U·mgprot-1GSH-Px/U·mgprot-1空白 - 13.88±1.67**56.48±4.49**979.37±81.70**模型 - 27.01±2.63 45.30±0.71 529.00±40.89聯(lián)苯雙酯 0.2 18.33±2.69**49.97±2.63*730.44±61.91**復方甘草酸苷片 0.113 21.67±2.07**51.75±4.01**802.84±124.45**波棱瓜子木脂素 0.375 21.58±2.85**53.03±2.64**892.88±103.17**0.75 17.59±1.68**54.27±4.39**989.26±140.89**1.5 18.48±1.66**51.02±2.20**928.99±238.69**3 17.03±2.35**53.29±3.70**961.17±248.44**

2.6 對小鼠肝勻漿MDA含量及SOD、GSH-Px活力的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝勻漿中MDA含量明顯升高, SOD、GSH-Px活性明顯下降(p<0.01), 表明ConA致免疫性肝損傷小鼠與氧化應激有一定的聯(lián)系. 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素對肝組織MDA的含量均有不同程度的降低, SOD、GSH-Px的活性有不同程度的升高(p<0.01), 表現(xiàn)出較好的抗氧化作用. 結果見表5.

2.7 對小鼠TNF-α、IFN-γ、NF-κB表達的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝臟中IFN-γ、TNF-α和NF-κB表達水平明顯升高(p<0.05). 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能明顯或部分降低小鼠肝組織中IFN-γ、TNF-α和NF-κB的表達(p<0.05). 結果見表6和圖2-4.

表6 波棱瓜子總木脂素對ConA致肝損傷小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、NF-κB表達的影響(±s ,n=10)Table 6 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of TNF-α, IFN-γ and NF-κB in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

表6 波棱瓜子總木脂素對ConA致肝損傷小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、NF-κB表達的影響(±s ,n=10)Table 6 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of TNF-α, IFN-γ and NF-κB in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

組別 劑量/g·kg-1TNF-α IFN-γ NF-κB空白 0.1654±0.0030**0.2506±0.0025*0.1750±0.0079*模型 0.1784±0.0029 0.2572±0.0028 0.1839±0.0053聯(lián)苯雙酯 0.2 0.1665±0.0052*0.2512±0.0038*0.1752±0.0102*復方甘草酸苷片 0.113 0.1662±0.0045*0.2510±0.0018*0.1750±0.0062*波棱瓜子木脂素 0.375 0.1798±0.0108 0.2565±0.0079 0.1785±0.0049 0.75 0.1762±0.0078 0.2571±0.0043 0.1762±0.0047 1.5 0.1753±0.0026 0.2540±0.0057 0.1860±0.0098 3 0.1665±0.0051*0.2511±0.0049*0.1750±0.0043*

表7 波棱瓜子總木脂素對ConA致肝損傷小鼠肝臟IL-4、IL-10表達的影響(±s , n=10)Table 7 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of IL-4and IL-10 in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

表7 波棱瓜子總木脂素對ConA致肝損傷小鼠肝臟IL-4、IL-10表達的影響(±s , n=10)Table 7 The effects of the total lignans from Tibetan Medicinal Herpetospermum Seeds on the express of IL-4and IL-10 in liver of liver injury mice induced by ConA(±s , n=10)

與模型組比較, * p<0.05, ** p<0.01.

等：川西獐牙菜多糖的提取及含量測定組別 劑量/g·kg-1IL-4 IL-10空白 - 0.2614±0.0122 0.2596±0.0058**模型 - 0.2799±0.0149 0.2471±0.0021聯(lián)苯雙酯 0.2 0.2618±0.0065 0.2562±0.0076*復方甘草酸苷片 0.113 0.2752±0.0090 0.2555±0.0068*波棱瓜子木脂素 0.375 0.2713±0.0148 0.2525±0.0099 0.75 0.2735±0.0155 0.2512±0.0056 1.5 0.2547±0.0101 0.2513±0.0065 3 0.2665±0.0295 0.2559±0.0056*

2.8 對小鼠IL-4、IL-10表達的影響

與空白組比較, 模型組小鼠肝組織中IL-4表達水平明顯升高, IL-10表達水平明顯降低(p<0.01). 與模型組比較, 波棱瓜子總木脂素能明顯或部分降低IL-4表達, 升高IL-10表達(p<0.05), 顯示出一定的抗炎作用. 結果見表7和圖5-6.

3 討論

肝臟是含酶豐富的臟器, 一旦肝細胞受損, 其胞漿中所含的各種酶可進入血液, 如ALT、AST、ALP等. 通過檢測血清中上述酶的活性, 可反映肝細胞受損情況. 本研究采用ConA致免疫性肝損傷動物模型對波棱瓜子總木脂素進行藥效篩選, 結果表明, 波棱瓜子總木脂素能顯著降低小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶ALT、門冬氨酸氨基轉移酶AST、堿性磷酸酶ALP水平, 糾正肝臟系數(shù)的變化, 提示波棱瓜子總木脂素對ConA致免疫性肝損傷有保護作用. 病理檢查結果表明, 波棱瓜子總木脂素能夠改善免疫性肝損傷肝臟組織病理學變化和肝臟組織炎癥. 其保護作用可能與阻止肝實質細胞膜通透性改變, 肝細胞的破損、壞死和程序性死亡有關.

研究表明, 肝臟損傷過程伴隨著嚴重的氧化應激反應. 其中, NO是體內典型的自由基, 充當神經(jīng)遞質、抑制血小扳聚集、介導免疫反應等功能, 是體內高效的氣體傳遞調節(jié)遞質. 免疫性等各種原因導致的肝損傷時, 肝細胞、枯否細胞合成NO增多, 活性氧的生成超過清除, 肝臟處于氧化應激狀態(tài). 實驗顯示, 波棱瓜子總木脂素能顯著降低血清NO含量和抑制與之相關的NOS的活力, 通過減弱NO過度表達而保護肝臟. MPO則是氧化應激的重要介質, 能介導炎性反應、調節(jié)免疫應答, 是中性粒細胞釋放的重要的過氧化物酶類, 通過釋放活性氧和其它毒性物質造成組織損傷. ConA經(jīng)尾靜脈注射可使MPO明顯升高, 表明肝臟組織炎癥反應十分明顯. 給予波棱瓜子

總木脂素可以降低ConA導致的MPO過高水平, 減少炎性細胞浸潤, 起到抗氧化損傷作用. 過高的自由基還可直接攻擊細胞膜脂質成分, 生成脂質過氧化產物. 其中MDA的含量高低與自由基損傷程度密切相關, 能增加細胞膜通透性, 造成生理功能紊亂, 導致肝細胞腫脹、壞死, 可反映機體脂質過氧化程度. SOD和GSH-Px是評定抗氧化水平主要觀察的生物化學指標. SOD是體內一種非常重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑, 可催化超氧陰離子的歧化反應, 其活性與清除超氧自由基能力成正相關, 可減輕肝細胞的損傷, 對維持體內過氧化物平衡起重要作用. GSH-Px廣泛存在于機體內, 是重要的過氧化物分解酶, 它可以催化脂質過氧化物的還原, 阻斷脂質過氧化反應, 起到保護細胞膜的作用[12-17]. 本實驗中ConA損傷肝臟, 導致肝組織中MDA含量異常升高, SOD和GSH-Px活性減弱. 連續(xù)給予波棱瓜子總木脂素7d, 可降低肝組織中MDA含量, 增強SOD和GSH-Px活性, 說明波棱瓜子總木脂素可能通過保護肝細胞膜, 清除自由基, 抑制脂質過氧化發(fā)揮其保護肝臟的作用.

在免疫性肝損傷中, 各種炎癥因子發(fā)揮著至關重要的作用. 雖然早期炎癥反應有助于宿主清除病原微生物;然而, 過度的炎癥反應對于宿主而言是一種極為有害的應激反應. 在本研究所采用的ConA所致肝損傷中, 各類炎癥因子發(fā)揮至關重要的作用, 而早期肝細胞損害與細胞因子作用有關, 在淋巴細胞浸潤前, 即已出現(xiàn)相關細胞因子的峰值. TNF-α、IFN-γ是參與該疾病模型最重要的細胞因子, 亦是是引起急、慢性肝損傷的重要因素之一. TNF-α是一種由活化的T細胞、NKT細胞及Kupffer細胞分泌的多效促炎性細胞因子的產物, 能激活T, B淋巴細胞,增加自然殺傷細胞的殺傷能力, 也能夠激活NF-κB信號轉導途徑, 引起各種炎癥因子的釋放, 直接或間接引起肝細胞的免疫損傷. 干擾素IFN-γ是由Th1細胞及NK細胞所分泌的巨噬細胞激活劑, 能增加巨噬細胞吞噬能力, 刺激細胞釋放氧化因子和TNF-α, 誘導Fas激活肝細胞的程序性死亡[18-25]. NF-κB能誘導與免疫和炎癥有關的多種細胞因子和粘附分子的表達, 是炎癥反應的上游環(huán)節(jié), 在免疫性肝損傷病理生理過程中高表達, 控制早期基因表達, 引起下游調控基因激活, 參與了肝損傷的發(fā)生和發(fā)展, 干預疾病過程, 影響機體的免疫應答、炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡過程[26]. IL-4是NKT細胞分泌產生, 通過自分泌進一步增加NKT細胞對肝臟細胞的細胞毒作用. IL-10是免疫抑制劑, 是抗炎性細胞因子, 對肝臟具有保護作用. 本實驗的研究結果顯示, 波棱瓜子總木脂素能夠促進抗炎性細胞因子IL-10的表達, 抑制IFN-γ、IL-4的過強表達, 減少TNF-α生成, 抑制NF-κB信號途徑的激活, 減少后續(xù)炎癥因子的釋放, 減輕肝細胞的損傷.

綜上所述, 波棱瓜子總木脂素連續(xù)給藥能夠降低ConA所致免疫性肝損傷小鼠血清酶活力升高, 改善肝臟病理損傷如炎癥、出血及壞死, 對免疫性肝損傷表現(xiàn)出一定的保護作用, 其機制與抗氧化應激、抗炎作用有關.

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The protective effect and its mechanism of total Lignans from Tibetan medicinal Herpetospermum Seeds on Concanavalin A-induced liver injury in mice

GU Jian, LI Jia-chuan, FAN Li-na
(Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:To investigate the protection effect and mechanism of the total Lignans from Tibetan MedicinalHerpetospermumSeeds on immunologic liver injury induced by ConA.Methods:Immunologic liver injury was induced by a single intravenous injection of ConA (20mg/kg). Then animals were sacrificed at the 8h post-injection, blood samples and liver were collected. Subsequently, organ index of liver, and biochemical parameters, such as ALT, AST, ALP, NO, NOS, MPO in serum and SOD, MDA, GSH-Px in liver tissue were evaluated. The pathological changes of the liver tissue were measured by HE staining. Finally, the expressions of TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10, NF-κB were tested with immunohistochemical method.

Herpetospermum seed; Hepatoprotective; concanavalin A; anti-inflammatory; anti-oxidant

圖1 對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織病理學影響(HE, ×100)Figure 1 The effects on the histopathologyof immunologic liver injury mice induced by ConA(HE, ×100)

圖2 對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的影響Figure 2 The effects on theTNF-α of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖3 對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織干擾素-γ(IFN-γ)的影響Figure 3 The effects on the liverIFN-γ of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖4 對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織細胞核轉錄因子(NF-κB)的影響Figure 4 The effects on the liver NF-κB of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖5 對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織白介素4(Il-4)的影響Figure 5 The effects on the liverIL-4 of immunologic liver injury mice induced by ConA

圖6 對ConA致免疫性肝損傷小鼠肝組織白介素10(Il-10)的影響Figure 6 The effects on the liverIL-10 of immunologic liver injury mice induced by ConA

R28; R29

: A

: 1003-4271(2014)03-0375-13

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.10

2014-04-04

顧健(1967-), 男, 漢族, 浙江武義人, 教授, 博士, 研究生導師, 研究方向: 民族藥物及中藥研究與開發(fā). E-mail：gujiancd@163.com.

國家自然科學基金(81674168）; 四川省科學技術廳科技攻關項目(2011 FZ0053); 四川省應用基礎研究項目(2012JY0027）資助.

Results:The total Lignans could reduce serum activities of ALT, AST, ALP, NOS, MPO and serum levels of NO. Meanwhile, lower serum levels of MDA and elevated activities of SOD and GSH-Px were observed in total Lignans treated liver injury mice. Furthermore, total Lignans significantly reduced the expressions of TNF-α, IFN-γ, IL-4 and NF-κB, and increased the expressions of IL-10. Pathological results also showed that the total Lignans could attenuate ConA-induced liver damage.Conclusion:The total Lignans from Tibetan MedicinalHerpetospermumSeeds have a certain Hepatoprotective effect on ConA-induced immunological liver injury in mice, which may be related its anti-oxidant and anti-inflammatory effects.