兩種配合飼料對(duì)刀鱭幼魚消化系統(tǒng)顯微結(jié)構(gòu)和功能的影響

魏廣蓮，徐鋼春，顧若波、，徐跑、

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214081;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214081)

魚類消化系統(tǒng)具有攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、消化食物，以及吸收營(yíng)養(yǎng)、排泄廢物等生理功能，在新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為了確定人工養(yǎng)殖過(guò)程中合理、高效的飼料配方，一些學(xué)者開展了魚類消化系統(tǒng)的組織學(xué)特征研究［1-3］，其中，關(guān)于食性和餌料對(duì)魚類消化系統(tǒng)形態(tài)學(xué)和組織學(xué)影響的研究較多［4-7］。

刀鱭Coilia nasus 隸屬于鯡形目、鳀科、鱭屬，又名長(zhǎng)頜鱭，俗稱刀魚，為中國(guó)長(zhǎng)江中重要的洄游性魚類［8］。因其豐腴肥滿、肉鮮味美、營(yíng)養(yǎng)豐富，享有“長(zhǎng)江三鮮”之一的美譽(yù)。自然條件下，刀鱭幼魚主要以枝角類、橈足類等浮游動(dòng)物為食，成魚以小魚、小蝦為食［9-10］;池塘養(yǎng)殖條件下，刀鱭在不同發(fā)育階段的攝食量與餌料生物的種類和數(shù)量密切相關(guān)［11］。隨著刀鱭人工繁育和用配合飼料對(duì)其馴養(yǎng)的成功，對(duì)刀鱭養(yǎng)殖用配合飼料的營(yíng)養(yǎng)成分、物理性狀等研究也有序展開。但有關(guān)刀鱭人工養(yǎng)殖中配合飼料的選擇及其對(duì)刀鱭消化系統(tǒng)和功能影響的研究目前尚未見報(bào)道。本研究中，采用成功馴養(yǎng)刀鱭所使用的兩種配合飼料投喂刀鱭幼魚后，分析刀鱭幼魚消化系統(tǒng)的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)的變化，以此對(duì)飼料進(jìn)行比較，旨在為刀鱭配合飼料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年9月在長(zhǎng)江靖江段捕撈長(zhǎng)江刀鱭幼魚，馴養(yǎng)于室內(nèi)水泥池(700 cm×435 cm×120 cm)中。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)前馴化養(yǎng)殖20 d，測(cè)得刀鱭幼魚的體質(zhì)量為(2.78 ±0.09)g，體長(zhǎng)為(9.50±0.51)cm。試驗(yàn)時(shí)將試驗(yàn)魚隨機(jī)分配到6個(gè)水泥池中，每池放養(yǎng)500 尾，分為2 組，每組設(shè)3 個(gè)平行。每天8:00、14:00 投喂，采用飽食法投喂，將餌料分幾次投入，每次投入均被攝食完，一直到刀鱭無(wú)攝食反應(yīng)、不來(lái)?yè)屖巢磐Ｖ雇段?。試?yàn)期間，平均水溫約23 ℃，溶氧≥6.0 mg/L，鹽度為0.45 ～0.60。飼養(yǎng)試驗(yàn)共進(jìn)行60 d。

1.2.2 人工飼料的配制 選取兩種常見的飼料進(jìn)行馴養(yǎng)試驗(yàn)，其中，飼料1 為配合飼料干粉料，購(gòu)自寧波天邦有限公司，按粉狀飼料與水分的質(zhì)量比為3∶2 均勻混合后再經(jīng)16 目篩網(wǎng)過(guò)濾，制成緩沉軟顆粒飼料，粒徑為1.3 ～1.6 mm;飼料2 為配合飼料緩沉硬顆粒料，粒徑為1.6 mm，購(gòu)自山東升索漁用飼料研究中心。兩種配合飼料的主要成分均為魚粉、蝦粉、大豆、小麥粉、維生素、鈣、磷等。兩種飼料的主要營(yíng)養(yǎng)成分(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))如表1所示。

表1 兩種飼料的基本營(yíng)養(yǎng)水平Tab.1 Basal nutrition levels of two formulated diets %

1.2.3 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算 飼養(yǎng)60 d 后進(jìn)行采樣，從每個(gè)池中隨機(jī)取9 尾魚進(jìn)行體質(zhì)量、體長(zhǎng)、內(nèi)臟質(zhì)量、肝臟質(zhì)量等常規(guī)生物學(xué)數(shù)據(jù)的測(cè)量，并用于肥滿度、臟體比、肝體比等指標(biāo)的計(jì)算，各生長(zhǎng)指標(biāo)的計(jì)算公式參照文獻(xiàn)［12］。

將胃、肝臟樣本分別加入10 倍的緩沖液(4℃)于冰浴下勻漿，制成體積分?jǐn)?shù)為10%的勻漿液，并于4 ℃下以2000 r/min 離心10 min，取上清液保存于冰箱(-20 ℃)中備用。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織上清液中蛋白質(zhì)的含量;使用試劑盒(購(gòu)自南京建成生物有限公司)測(cè)定胃上清液中的胃蛋白酶、淀粉酶活性，以及肝臟上清液中的脂肪酶活性;用CPT-I、CPT-Ⅱ和ACC 定量檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定肝臟中肉堿軟脂?；D(zhuǎn)移酶-Ⅰ(CPT-Ⅰ)、肉堿軟脂?；D(zhuǎn)移酶-Ⅱ(CPT-Ⅱ)和乙酰CoA 羧化酶(ACC)的含量，試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)池中采集3 尾幼魚的胃、腸、肝樣本，用Bouin's 液固定，48 h 后將腸分為前、中、后腸，再用Bouin's 液固定48 h，進(jìn)行清洗、脫水、二甲苯透明浸蠟和石蠟包埋，用Leica RM2235 切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為6 μm，再用H.E 染色、中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

刀鱭的生長(zhǎng)指標(biāo)和酶活性指標(biāo)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 11.7 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用LSD 法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種飼料對(duì)刀鱭幼魚生長(zhǎng)性能和相關(guān)酶活性的影響

從表2可見:兩組刀鱭幼魚的存活率都比較高，均在96%以上;飼料2 組幼魚的終末體質(zhì)量、增重率、肥滿度和特定生長(zhǎng)率均顯著高于飼料1 組(P＜0.05);兩組幼魚的終末體長(zhǎng)、存活率、肝體比和臟體比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表2 兩種飼料對(duì)刀鱭幼魚生長(zhǎng)指數(shù)和形體指標(biāo)的影響Tab.2 Effect of different diets on growth performance and morphology of juvenile estuary tapertail anchovy Coilia nasus

從表3可見:兩組刀鱭幼魚胃里的淀粉酶和胃蛋白酶活性均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);飼料2 組刀鱭幼魚肝臟中的脂肪酶活性顯著高于飼料1 組(P＜0.05);飼料2 組幼魚肝臟中的CPT-Ⅰ含量顯著低于飼料1 組(P＜0.05)，而兩組的CPT-Ⅱ和ACC 含量均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 兩組刀鱭幼魚肝臟的形態(tài)和組織學(xué)特征

刀鱭肝細(xì)胞的大小基本相似，形態(tài)卻多種多樣，有的呈橢圓，有的呈多角形或梭狀。其細(xì)胞核較大且輪廓清晰，為單個(gè)或者兩個(gè)，位于細(xì)胞中間或偏位(圖1-A、C)。通過(guò)H.E 染色觀察可見，兩組刀鱭幼魚的肝組織之間無(wú)明顯差異，但飼料2組刀鱭幼魚的肝臟細(xì)胞質(zhì)中清晰可見明亮的脂肪滴存在，細(xì)胞質(zhì)被脂肪擠壓，多呈斑塊狀或圍繞在細(xì)胞核外呈薄層狀(圖1-A、B)。

表3 兩種飼料對(duì)刀鱭幼魚消化酶和脂肪代謝酶等的影響Tab.3 Effect of different diets on activities of the digestive enzymes and fat metabolism enzymes in juvenile estuary tapertail anchovy Coilia nasus

2.3 兩組刀鱭幼魚胃的形態(tài)和組織學(xué)特征

通過(guò)H.E 染色觀察可見，刀鱭幼魚胃里的食物尚未完全消化，飼料2 組刀鱭幼魚的胃中飼料顆粒較小，且大小均勻，而飼料1 組刀鱭幼魚的胃中飼料顆粒較大，且呈現(xiàn)出整塊未消化狀態(tài)(圖1-D、E)。飼料1 組刀鱭幼魚胃壁上的皺褶比飼料2組多，平均有5 ～7 個(gè)較大的呈馬鞍狀的皺褶，且黏膜皺褶較高，而飼料2 組卻沒有(圖1-D、E)。

圖1 兩組刀鱭幼魚消化系統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphology and histology of the digestive system between two groups in the juvenile estuary tapertail anchovy Coilia nasus

2.4 兩組刀鱭幼魚腸道的形態(tài)和組織學(xué)特征

刀鱭腸道為一直筒型管狀物，腸壁分為黏膜層、黏膜下層、肌肉層、漿膜層。樣本固定時(shí)將其分為前腸、中腸和后腸。通過(guò)H.E 染色觀察，兩組刀鱭幼魚的腸道特征基本相似。腸壁黏膜層形成非常豐富的絨毛，絨毛呈毛發(fā)狀，數(shù)目多，且有的有分支，呈細(xì)長(zhǎng)爪狀，伸向管腔，有的還包裹著食物殘?jiān)?。兩組刀鱭幼魚前腸絨毛較多，絨毛基部還可清晰地看到消化酶分泌物。絨毛數(shù)量從前腸到后腸逐漸減少，高度也逐漸降低，這與消化吸收能力相關(guān)。前腸直徑最大，后腸直徑次之，中腸直徑最小;前腸的黏膜褶最高，褶的數(shù)目最多且分布緊密、規(guī)則;中腸黏膜褶的高度較前腸稍低，褶的基部變寬(圖1-F、G、H)，分布稀疏，數(shù)目減少。此外，飼料2 組刀鱭幼魚的前腸直徑、黏膜褶高度和肌層厚度比飼料1 組略大，飼料1 組刀鱭幼魚的后腸直徑比飼料2 組略大，但均未達(dá)到顯著性差異水平(P＞0.05)(表4)。

表4 兩組刀鱭幼魚前腸、中腸、后腸組織結(jié)構(gòu)的比較Tab.4 The histological structure comparison of foregut，midgut and hindgut in juvenile Coilia nasus between two groups

3 討論

肝臟是機(jī)體最大的消化腺［13］，在魚類的食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收和機(jī)體代謝等過(guò)程中起著重要作用。研究表明，大部分肉食性魚類肝臟與脂肪代謝有著不可分割的關(guān)系，體內(nèi)肝臟脂肪的儲(chǔ)存量對(duì)魚類越冬和性腺發(fā)育具有十分重要的作用［14］。深入了解肝臟的生理結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)可以為刀鱭幼魚機(jī)體代謝和營(yíng)養(yǎng)吸收提供重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)資料。本研究中，從組織學(xué)角度對(duì)肝臟組織細(xì)胞進(jìn)行了觀察和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60 d 的試驗(yàn)中，兩種飼料并沒有對(duì)刀鱭幼魚的肝臟組織細(xì)胞造成明顯差異。但是，飼料1 組刀鱭幼魚的肝體比值比飼料2組略高，飼料2 組刀鱭幼魚的肥滿度和肝臟中的脂肪酶含量均比飼料1 組高，飼料2 組刀鱭幼魚的肝細(xì)胞質(zhì)中清晰可見明亮的脂肪滴，這正好與飼料2組肝臟中脂肪酶含量高相吻合，說(shuō)明飼料2 組幼魚攝取較多含高脂肪的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可能與飼料2 中粗脂肪含量高有關(guān)。另外，飼料1 組脂肪分解的限速酶CPT-I 含量高于飼料2 組，而脂肪合成限速酶ACC 含量卻低于飼料2 組，說(shuō)明飼料1 組刀鱭幼魚脂肪酶分解速度快，而合成速度慢，魚體內(nèi)沒有過(guò)多的脂肪沉積，肥滿度和特定生長(zhǎng)率必然會(huì)低于飼料2 組。本試驗(yàn)中形體指標(biāo)結(jié)果正好表明這一點(diǎn)，這也與張媛媛等［12］的研究結(jié)果相一致。因此，在人工養(yǎng)殖過(guò)程中，要保證配合飼料中蛋白質(zhì)和脂肪的含量，從而保證飼料營(yíng)養(yǎng)的全面性。

魚類胃的主要功能是消化食物中的蛋白質(zhì)［15］。胃在消化食物時(shí)，胃壁運(yùn)動(dòng)，其黏膜層會(huì)形成皺褶，皺褶表面會(huì)形成很多U 形的胃小凹，用于快速磨碎食物。潘黔生等［15］認(rèn)為，胃黏膜表面結(jié)構(gòu)和分泌能力是胃對(duì)食物消化吸收的關(guān)鍵因素，而黏膜表面結(jié)構(gòu)，主要與褶皺的變化情況及上皮杯狀細(xì)胞的多少等有關(guān)，其結(jié)構(gòu)狀況可間接反映魚類的消化能力和食物消化的難易狀況。本試驗(yàn)中，相同時(shí)間段采樣，飼料1 組刀鱭幼魚胃里的皺褶較多，黏膜上皮的杯狀細(xì)胞數(shù)量多，胃里的淀粉酶和胃蛋白酶活力指數(shù)高(表3)，且食物顆粒大小不均;相比之下，飼料2 組刀鱭幼魚胃里的皺褶較少，黏膜上皮的杯狀細(xì)胞數(shù)量少，淀粉酶和胃蛋白酶活力指數(shù)低，食物顆粒大小均勻。這可能與兩組刀鱭幼魚的消化能力及所攝食飼料的組成成分有關(guān)。

從飼料成分上來(lái)看，飼料2 組的蛋白含量和干物質(zhì)含量都比飼料1 組高，從理論上講，同樣的時(shí)間里飼料2 組應(yīng)該比飼料1 組消化的慢，淀粉酶和胃蛋白酶活性應(yīng)該高于飼料1 組，但實(shí)際情況恰好相反。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料2 組刀鱭幼魚的體質(zhì)量、體長(zhǎng)、增重率、內(nèi)臟比、肥滿度、特定生長(zhǎng)率等均高于飼料1 組，這說(shuō)明并不是飼料1 比飼料2難以消化，而是飼料2 組刀鱭幼魚的消化吸收能力比飼料1 組強(qiáng)，這可能是飼料2 的組成成分提高了刀鱭幼魚的消化功能。

在多數(shù)硬骨魚類中，前腸腸腔膨大，管徑大，而且管壁肌肉層十分發(fā)達(dá)，這將有助于食物在腸道中的推進(jìn)［16-17］。前腸主要是吸收脂類物質(zhì)的場(chǎng)所，在前腸黏膜的上皮細(xì)胞中有脂質(zhì)吸收細(xì)胞，這被認(rèn)為是類脂等物質(zhì)的臨時(shí)儲(chǔ)存處［18］。腸壁上皮細(xì)胞胞質(zhì)上方有分散存在的溶酶體，會(huì)產(chǎn)生很多有助于物質(zhì)消化的酶類，可以把糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等分解成為可溶性小分子，這樣有助于魚類對(duì)物質(zhì)的消化和吸收。

本試驗(yàn)中，飼料2 組刀鱭幼魚的前腸直徑、黏膜褶高度和肌層厚度均比飼料1 組的高，這可間接反映魚類消化、吸收的能力。這種現(xiàn)象可能是兩種因素造成的:一是魚類前腸消化能力的改善，二是食物的組成成分［19］。從飼料2 的基本營(yíng)養(yǎng)組成來(lái)看，粗脂肪和粗蛋白等含量都比飼料1 組高，說(shuō)明飼料2 組刀鱭幼魚前腸的消化能力在飼料2 的作用下有所改變，呈增強(qiáng)趨勢(shì)。這為用飼料營(yíng)養(yǎng)成分改善魚類消化道結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究提供了參考。本試驗(yàn)中，飼料1 組刀鱭幼魚的后腸直徑比飼料2 組大，說(shuō)明飼料1 組食物消化后的殘?jiān)Ｓ噍^多，需要排出的糞便較多。飼料2 組刀鱭幼魚的體質(zhì)量、肥滿度、特定生長(zhǎng)率等都顯著高于飼料1 組，說(shuō)明飼料1 組刀鱭幼魚對(duì)飼料1 的消化吸收利用率明顯比飼料2 組低。

綜上所述，從刀鱭幼魚攝食兩種配合飼料后的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)及消化系統(tǒng)組織學(xué)變化結(jié)果看，幼魚對(duì)飼料2 的利用效率比飼料1 高，攝食飼料2 組幼魚的生長(zhǎng)較佳。另外，飼料的組成成分會(huì)在一定程度上影響幼魚消化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，在刀鱭幼魚養(yǎng)殖初期可適當(dāng)提高配合飼料中蛋白質(zhì)和脂肪的含量，從而保證飼料營(yíng)養(yǎng)的全面性，促進(jìn)刀鱭幼魚生長(zhǎng)。

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