飼料中亞油酸和亞麻酸含量對團頭魴幼魚生長、體成分和消化酶活性的影響

王煜恒，劉文斌，王會聰，陳軍，駱桂蘭，邢軍

(1.江蘇農林職業(yè)技術學院 畜牧獸醫(yī)系，江蘇 鎮(zhèn)江212400;2.南京農業(yè)大學 動物科技學院 江蘇省水產動物營養(yǎng)重點實驗室，江蘇南京210095)

魚類的必需脂肪酸(essential fatty acid，EFA)是一些不能由魚體自身合成而只能由食物提供的滿足其正常生長發(fā)育及維持細胞組織功能所必需的多不飽和脂肪酸。必需脂肪酸缺乏或者相互之間組成不平衡，均會導致魚類生長速度及飼料轉化率下降，肌肉中水分和肝臟中脂肪含量顯著增加，并引發(fā)多種病理缺乏癥［1-3］。淡水魚和海水魚在EFA需求上存在較大差異，淡水魚能利用18 碳脂肪酸合成20 碳或22 碳脂肪酸，因此，它的EFA 主要是C18:2n-6(linoleic acid，LA)和C18:3n-3(α- linolenic acid，ALA)，而海水魚主要對高不飽和脂肪酸如C20:5n-3(EPA)和C22:6n-3(DHA)需求比較大［4］。

以往研究EFA 需要量的試驗都采用單因素設計，即在飽和或單不飽和脂肪酸的基礎上添加單一的EFA，最近有學者開始通過在脂肪中添加兩種或更多的EFA 來研究各種EFA 之間的交互作用。Smith等［5］通過4 ×4 雙因子試驗發(fā)現(xiàn)，砂鱸Bidyanus bidyanus 對LA 的最適需要量為1.7 g/kg;斑節(jié)對蝦Penaeus monodon 飼料中n -3和n -6 系列EFA 的比例為2.5 ～1.0 時，其生長效果最佳［6］;黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco日糧中ALA 與LA 的比例為1.17和2.12 時，其增重率最高且飼料系數(shù)最低［7］。但EFA 之間交互作用的機理目前尚不清楚，推測可能與其改變細胞膜結構，或者其變構效應對脂肪酸去飽和酶和競爭性底物的影響有關［8］。

團頭魴Megalobrama amblycephala是中國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一。目前關于團頭魴對EFA 需要量的研究尚未見報道，劉瑋等［9］在不同脂肪源對團頭魴幼魚生長影響的研究中發(fā)現(xiàn)，團頭魴的EFA 應同時包含LA和ALA，且對LA 的需求要比對ALA 更大。Takeuchi等［10］認為，鯉Cyprinus carpio 的EFA 應包括1%的LA和1%的ALA，草魚Ctenopharyngodon idella［11］的EFA 與 鯉 相 似，為0.5% ～1.0%的ALA和1.0%的LA。鑒于團頭魴同屬鯉科魚類，對EFA 的需要量應該比較相近，因此，本試驗在前人研究的基礎上［12］，通過在含35%蛋白質和7%脂肪的基礎日糧中添加LA(3 個水平)和ALA(3 個水平)，探討LA和ALA 的不同含量對團頭魴幼魚生長性能、形體指標、體成分和消化酶活性的影響，從而確定團頭魴幼魚對這兩種EFA 的最適需要量，以期為團頭魴的脂肪酸需求研究和飼料油脂的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在南京農業(yè)大學水產動物營養(yǎng)和生態(tài)實驗室進行。試驗用魚為購自上海松江浦南水產良種場的團頭魴“浦江1 號”夏花。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計與試驗飼料 試驗設3 個LA 水平(0.5%、1.0%、1.5%，占飼料質量比)和3個ALA 水平(0.5%、0.9%、1.3%)，采用3 ×3雙因子設計方法配制成9種飼料，記為L0.5A0.5、L0.5A0.9、L0.5A1.3、L1.0A0.5、L1.0A0.9、L1.0A1.3、L1.5A0.5、L1.5A0.9、L1.5A1.3，分別投喂9 組魚，每組設4 個重復。以酪蛋白和明膠為主要蛋白源，玉米淀粉為糖源，羧甲基纖維素為黏合劑，并填充微晶纖維素、礦物質等制成等氮等能的基礎日糧?；A日糧配方(均為質量分數(shù)，%)為:酪蛋白32.00、明膠8.00、玉米淀粉30.00、微晶纖維素15.50、羧甲基纖維素3.00、預混料1.00、磷酸二氫鈣1.90、沸石粉2.00、抗氧化劑0.10、氯化鈉0.50、油脂6.00。以魚油、豆油、花生油、亞麻油、油酸和棕櫚酸為脂肪源，通過幾種油脂的不同配比來調節(jié)日糧中LA和ALA的水平。飼料營養(yǎng)組成及油脂配制見表1，飼料脂肪酸組成見表2。將各組飼料逐級混合均勻，再加水拌勻，用QRLS-150Ⅱ型電動絞肉機制成顆粒，成型后先進行破碎再經20 ～40 目(粒徑為380 ～830 μm)篩兩次篩分，25 ℃下風干，置于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗前先于試驗環(huán)境下投喂商品料暫養(yǎng)，馴化10 d 后，選取體格健康、無畸形體質量為(0.80 ±0.02)g 的團頭魴魚苗720 尾，隨機投放36 個水族箱(直徑為52 cm，水深為50 cm)中，每箱20 尾。試驗期間，每3天換水一次，每次換水量為總水量的30%。每天7:00、12:00、17:00 投飼，日投飼率為魚體質量的3% ～5%，投喂之前吸出糞便，飼料投喂持續(xù)20 min，投喂結束后30 min，撈出殘餌烘干稱重。試驗周期為56 d。試驗用水為曝氣自來水，水溫為(27 ±3)℃，pH 為6.8 ～8.0，溶解氧＞5 mg/L。

1.2.3 指標的測定與計算

(1)生長性能與營養(yǎng)成分。試驗魚養(yǎng)殖56 d后，停飼24 h，測定總質量，計算增重率、特定生長率、飼料系數(shù)、蛋白質效率，并隨機從每箱取6尾魚測量體長、體質量，解剖取其肝胰臟及全部內臟稱重，計算肥滿度、肝胰臟指數(shù)和臟體指數(shù)。同時取腸道，并將剩余的所有幼魚用4 ℃預冷的鹽度為8.6 的生理鹽水沖洗，然后用濾紙吸干水分，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。參照AOAC［13］的方法測定飼料和魚體中的水分、粗蛋白質和灰分含量，干物質烘干(105 ℃)至恒重，通過失重法測定;用凱氏定氮儀(2300Kjeltec Analyzer Unit，F(xiàn)OSS TECATOR，Sweden)測定粗蛋白含量;用馬福爐(550 ℃)燃燒失重法測定灰分含量;參照Folch等［14］的方法測定粗脂肪含量。每個樣品至少測定3 個平行。增重率(WG)、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)、蛋白質效率(PER)、肥滿度(CF)、肝體指數(shù)(HSI)、臟體指數(shù)(VSI)的計算公式為

表1 飼料營養(yǎng)組成及油脂配制Tab.1 Approximate composition of the experimental diets and preparation of the dietary fat

(2)消化酶。將腸道解凍之后準確稱重，使用去離子水按質量比為1∶ 9 進行冰浴勻漿，以3000 r/min 離心10 min，收集上清液標號分裝待測，于4 ℃下保存，24 h 內測定完畢。采用福林-酚法測定總蛋白酶［15］。采用南京建成公司的試劑盒測定各種消化酶活性。蛋白酶活力單位定義為:在27 ℃條件下，每分鐘水解酪素產生相當于1 μg酪氨酸所需的酶量為1 個酶活力單位。脂肪酶活力單位定義為:在27 ℃條件下，每克組織蛋白在本反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol 底物為1 個酶活力單位。淀粉酶活力單位定義為:每毫克蛋白在27 ℃下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1 個酶活力單位。

(3)脂肪酸。飼料樣品中脂肪的提取參照Folch等［14］的方法。油脂的皂化及甲酯化方法參照Christie［16］的方法，略有改進。樣品皂化甲酯化后，用氣相色譜-質譜儀進行分析。分析儀器為島津GCMS-QP2010 Plus 氣質聯(lián)用儀，色譜柱為HP -5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);色譜柱升溫程序為初溫50 ℃，以10 ℃/min 升至150 ℃并保持3 min，以3 ℃/min 升至230 ℃保持3 min;進樣方式為分流進樣，分流比為10∶ 1，進樣量為1 μL，載氣為高純氮氣，氣流為1.3 mL/min。檢索NIST質譜圖庫，比較樣品質譜圖與圖庫中標準質譜圖，即可確定樣品中脂肪酸種類，采用面積歸一化法計算各脂肪酸的相對含量。

表2 各組試驗飼料脂肪酸的組成Tab.2 The fatty acid composition of the experimental diets w/%

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用平均值± 標準誤(means ±S.E.)表示。采用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。當差異顯著時，以飼料LA和ALA 添加水平為主要影響因子，進行雙因素方差分析，采用Duncan 法進行組間多重比較。

2 結果與分析

2.1 LA和ALA 含量對幼魚生長性能的影響

養(yǎng)殖試驗期間，各試驗組幼魚肉眼未發(fā)現(xiàn)組織病變。從表3可見:飼料中LA和ALA 含量對團頭魴幼魚WG和SGR 的影響極顯著(P＜0.01);當飼料中LA 的添加量為0.5%時，幼魚的WG、SGR和PER 均顯著低于其他兩個LA 組(P＜0.05);而當ALA 添加量為0.9%時，幼魚的WG、SGR和PER 均顯著高于1.3%組(P＜0.05)，但與0.5%組無顯著性差異(P ＞0.05)。同時發(fā)現(xiàn):LA 與ALA 之間存在交互作用，當飼料中LA 含量為1.0%且ALA 的含量為0.9%時，其WG和SGR 均達 到 最 高，顯 著 高 于L0.5A0.5、L0.5A1.3和L1.5A1.3 組(P＜0.05)，但與其他組無顯著性差異(P ＞0.05);L1.0A0.5 組PER 為各組最高且與L1.0A0.9、L1.5A0.5和L1.5A0.9 組無顯著性差異(P ＞0.05)，但顯著高于其他組(P＜0.05)。觀察FCR 發(fā)現(xiàn)，當飼料中ALA 為1.3%時，顯著高于其他兩個ALA 組(P＜0.05)，而LA 添加量對其無顯著影響(P ＞0.05)。各試驗組存活率無顯著性差異(P ＞0.05)。通過二次回歸分析得到增重率(y)與LA(x)的關系式為y=-96.043x2+208.88x+265.3(R2=0.3337)，當增重率最高時LA 為1.09%，其回歸曲線見圖1。同時建立增重率(y)與ALA(x)的關系式為y=-154.77x2+260.08+269.93(R2=0.3293)，當增重率最高時ALA 為0.84%，其回歸曲線見圖1。

表3 飼料中亞油酸和亞麻酸含量對團頭魴幼魚生長性能的影響Tab.3 Effect of dietary linoleic acid and linolenic acid levels on growth performance in juvenile blunt snout bream

2.2 LA和ALA 含量對幼魚形體指標的影響

從表4可見:飼料中LA和ALA 含量對團頭魴HSI和VSI 無顯著影響(P ＞0.05)，但隨著飼料中LA和ALA 含量的增加HSI 均呈下降趨勢，L0.5A0.5 組的HSI 達到2.80，為各組最高;LA為1.0%組的VSI 略小于其他兩個LA 組，而ALA為1.3%組的VSI 略高于其他兩個ALA 組;團頭魴幼魚的CF 受LA 的影響顯著(P＜0.05)，LA 為1.0%組的CF 顯著高于其他兩個LA 組(P＜0.05)，ALA 對CF 影響不顯著(P ＞0.05)，但0.9%組的CF 略高于其他兩個ALA 組。

圖1 飼料中亞油酸和亞麻酸含量與增重率的關系Fig.1 Effect of dietary LA，and ALA levels on weitght gain of blunt snout bream

表4 飼料中亞油酸和亞麻酸含量對團頭魴幼魚形體指標的影響Tab.4 Effect of dietary LA and ALA levels on morphometric index of juvenile blunt snout bream

2.3 LA和ALA 含量對幼魚體組成的影響

從表5可見，飼料中LA和ALA 對全魚的粗蛋白質與粗灰分含量均無顯著影響(P ＞0.05)。LA為1.0%組的全魚粗蛋白質含量略高于其他兩個LA 組，但粗蛋白質含量隨ALA 添加量的增加呈下降趨勢;LA 為0.5%組的全魚水分含量顯著高于其他兩個LA 組(P＜0.05);LA 為0.5%組的全魚粗脂肪含量顯著低于其他兩個LA 組(P＜0.05);ALA 對全魚水分和粗脂肪含量均無顯著影響(P ＞0.05);LA和ALA 均對肝胰臟脂肪含量的影響顯著(P＜0.05)，LA 為0.5%組顯著高于其他兩個LA 組(P＜0.05)，ALA 為0.9%組顯著低于其他兩個ALA 組(P＜0.05)，但LA和ALA對肝胰臟脂肪含量不存在交互作用，L0.5A0.5 組的肝胰臟脂肪含量為各組最高。

2.4 LA和ALA 含量對幼魚消化酶活性的影響

從表6可見:飼料中LA和ALA 對團頭魴腸道淀粉酶活性無顯著影響(P ＞0.05);LA 為1.0%組的腸道脂肪酶活性顯著高于LA 為0.5%組(P＜0.05)，但與1.5%組無顯著性差異(P ＞0.05)，ALA 為1.3%組顯著低于其他兩個ALA 組(P＜0.05)，此外兩種EFA 對脂肪酶存在交互作用，L0.5A0.5和L1.5A1.3 組顯著低于L1.0A0.5和L1.0A0.9 組(P＜0.05)，其他組之間無顯著性差異(P ＞0.05);LA 為0.5%組的腸道蛋白酶活性顯著低于其他兩個LA 組(P＜0.05)，ALA 為1.3%組的蛋白酶活性顯著低于其他兩個ALA 組(P＜0.05)。

3 討論

本試驗中通過在等氮等能的純合飼料基礎上添加不同水平的LA和ALA，在各組飼料中提供等量的EPA和DHA 來研究團頭魴幼魚對這兩種脂肪酸的需求量，由于飼料中EFA 過量或缺少時都會對魚類的增重率產生影響［17］，所以本試驗中以團頭魴幼魚的增重率作為主要評判指標來研究幼魚對這兩種脂肪酸的適宜需求量。結果表明:增重率隨LA 含量的增加而逐漸升高，當LA 添加量為1.0%時達到最高，而LA 增加到1.5%時增重率有所下降但不顯著;當ALA 添加量為0.5%和0.9%時，增重率無顯著差異，但當ALA 達到1.3%時對團頭魴生長有一定的阻礙作用。Glencross等［18］研究表明:斑節(jié)對蝦的增重率隨飼料中ALA 含量的增加而升高，當ALA 達到2.6%時其增重率最高，再增加時就對其生長產生消極影響;LA 對生長雖有促進作用，但過量時對生長的抑制作用可能與ALA的交互作用有關。Smith等［5］研究砂鱸對LA和ALA 的需要量時發(fā)現(xiàn)，隨LA 含量的增加其增重率升高，最適添加量為1.8%，當添加量為2.3%時增重率明顯下降，但ALA 對增重率影響不顯著。本試驗結果與上述研究相似，團頭魴幼魚同樣對LA和ALA 的需要量有一個適宜范圍，添加量過多或過少都會影響其生長，參照Zuridah等［19］的方法進行二次回歸分析，得出當LA 為1.09%和ALA為0.84%時可使增重率分別達到最高。本試驗中發(fā)現(xiàn)，LA和ALA 對增重率的影響存在一定的交互作用，Glencross等［18］認為，飼料中LA和ALA 的交互作用對增重率的影響與這兩種EFA在飼料中的平衡(即飼料中LA和ALA 應保持適宜水平和比例)密切相關，這種平衡性主要體現(xiàn)在LA和ALA在體內進行生物合成HUFA 過程中兩者對△6和△5 去飽和酶系統(tǒng)底物的競爭性抑制［20］。本試驗中發(fā)現(xiàn)，各組飼料系數(shù)普遍偏高，推測可能與純合飼料適口性較差和消化吸收率低有關;LA 對飼料系數(shù)影響不大，但當ALA 添加過量后會導致飼料系數(shù)升高，這可能與過量ALA 會阻礙團頭魴幼魚生長有關。

表5 飼料中亞油酸和亞麻酸含量對團頭魴幼魚全魚體組成的影響(濕質量)Tab.5 Effect of dietary LA and ALA levels on whole body composition(wet weight basis)of juvenile blunt snout bream w/%

表6 飼料中亞油酸和亞麻酸含量對團頭魴幼魚腸道消化酶活性的影響Tab.6 Effect of dietary LA and ALA levels on activities of intestinal digestive enzymes in juvenile blunt snout bream

Takeuchi等［21］研究了EFA 對虹鱒Oncorhynchus mykiss 的營養(yǎng)功能，發(fā)現(xiàn)EFA 缺乏可使該魚肝臟脂質特別是中性脂肪大量積累，而磷脂含量大幅降低。其他學者在大菱鲆Scophthalmus maximus［22］和鮭魚Oncorhychus keta［23］等魚類中也觀察到，缺乏EFA 時魚類肝臟中脂質積累增加并且肝質量相對增大。本試驗結果表明，LA 為0.5%組的魚體肝胰臟脂肪含量顯著高于其他兩個LA 組，LA 對魚體肝體指數(shù)的影響雖不顯著但趨勢相似，這些表明，當LA 添加量為0.5%時不能滿足魚體需要，導致EFA 缺乏。飼料中ALA 對魚體肝胰臟脂肪含量和肝體指數(shù)的影響結果顯示，添加0.9%的ALA時團頭魴幼魚肝臟表現(xiàn)的更為健康。Lee等［24］對星斑川鰈Platichthys stellatus 的研究發(fā)現(xiàn)，當EFA 缺乏時全魚的粗脂肪含量也有所降低。本試驗中發(fā)現(xiàn):LA 為0.5%組的全魚粗脂肪含量顯著小于LA為1.0%和1.5%組;ALA 對全魚粗脂肪含量的影響雖不顯著，但ALA 為0.9%組還是要稍高于其他兩個ALA 組，由此認為，LA 為1.0%和ALA 為0.9%時，更能滿足魚體EFA 的需要。

本試驗中發(fā)現(xiàn):LA 為1.0%時團頭魴幼魚的肥滿度顯著高于0.5%和1.5%組，LA 對全魚粗蛋白質含量的影響無顯著性差異，但1.0%組粗蛋白質含量稍高于其他兩個LA 組;ALA 對肥滿度無顯著影響，但ALA 為0.9%時為3 組中最高。薛敏等［25］認為，魚類的生長效果和魚體品質與飼料中EFA 的適宜含量和比例密切相關。結合本試驗中當LA 為1.0%和ALA 為0.9%時，魚體肥滿度、全魚粗蛋白質、粗脂肪含量較高，肝胰臟脂肪含量較低，說明此時飼料中EFA 的含量是適宜的。

當考慮LA 與ALA 的交互作用影響時，L1.0A0.9、L1.5A0.5、L1.5A0.9 組的相關指標均較好，而L1.0A0.5、L1.0A1.3、L1.5A1.3 組也未表現(xiàn)出 EFA 極度缺乏或者過量癥狀，僅L0.5A0.5、L0.5A0.9、L0.5A1.3 組表現(xiàn) 出EFA不足的可能癥狀，故從對形體指標和機體成分的影響綜合分析，團頭魴幼魚對LA、ALA 均需要，但對LA 的需求更大，當LA 為0.5%時可能會產生EFA 缺乏，當LA 為1.5%和ALA 為1.3%時也能耐受。

魚類消化酶活性的高低能直接反映對營養(yǎng)物質的消化吸收能力，提高魚體的消化酶活性就能提高魚對營養(yǎng)物質的消化能力，魚類對營養(yǎng)物質的吸收也會隨之增加［26］。本試驗結果顯示:當LA 的添加量為1.0%時，腸道脂肪酶活性最大;ALA 添加水平為1.3%時能顯著降低脂肪酶活性。作者推測，這兩種EFA可能通過消化酶影響魚體消化吸收，從而造成對魚體體脂沉積的改變，但有待進一步試驗驗證。飼料中LA和ALA 對蛋白酶的影響顯著，當LA 過低和ALA 過高時都會導致蛋白酶活性降低，雖然EFA 對蛋白酶活性的影響未顯著改變魚體組織中蛋白質的積累，但是可以通過提高團頭魴對蛋白質的利用率，促進魚體生長。

綜上所述，從團頭魴幼魚的生長性能、形體指標、體成分和消化酶數(shù)據(jù)來看，團頭魴幼魚對LA的需要量為1.0% ～1.5%，對ALA 的需要量為0.5% ～0.9%。通過二次回歸方程分析得出，當LA 為1.09%和ALA 為0.84%時，團頭魴幼魚生長較好，各項生理機能指標正常。

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