配合飼料、冰鮮雜魚對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)和LPL基因mRNA表達(dá)的影響

朱擇敏，馬冬梅，白俊杰，樊佳佳，廖國(guó)禮，梁旭方

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶魚類選育與養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510380;2.暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)系，廣東 廣州510632)

大口黑鱸Micropterus salmoides 又名加州鱸，是一種原產(chǎn)于北美的廣溫性肉食性魚類，目前，大口黑鱸的養(yǎng)殖主要靠投喂冰鮮雜魚，開發(fā)適合的人工配合飼料已成為大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點(diǎn)。喂食人工配合飼料的大口黑鱸肝臟易受到損傷［1］，因此，開展飼料中脂肪含量對(duì)魚體生長(zhǎng)、脂肪代謝及其基因表達(dá)影響的研究具有重要意義。

脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)的作用主要是催化乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，產(chǎn)生供機(jī)體組織利用的脂肪酸和單酰甘油［2-3］。大口黑鱸兩種LPL 的全長(zhǎng)cDNA 已得到克隆，并運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR 方法檢測(cè)了脂蛋白脂肪酶mRNA 的組織分布，發(fā)現(xiàn)LPLtype1和LPLtype2均在肝臟中表達(dá)量最高，這可能與肝臟是最主要的營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)性貯脂部位有關(guān)［4］。

有關(guān)飼料中不同脂肪水平對(duì)大口黑鱸營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)、肌肉組織成分、非特異性免疫，以及與生長(zhǎng)相關(guān)的基因表達(dá)影響的研究已有報(bào)道［5-8］，但從分子水平分析飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸脂肪代謝的研究還很少。本研究中，不僅檢測(cè)了不同脂肪水平飼料對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響，還從分子水平檢測(cè)了對(duì)肝臟中兩個(gè)脂蛋白脂肪酶基因mRNA表達(dá)量的影響，分析了飼料中的脂肪含量與生長(zhǎng)及肝臟脂肪代謝基因的相互關(guān)系，旨在為研究大口黑鱸對(duì)外源脂肪的適應(yīng)和調(diào)節(jié)能力提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所良種基地人工繁殖大口黑鱸，體質(zhì)量約為40 g。

1.2 方法

1.2.1 人工配合飼料的制備 試驗(yàn)用冰鮮雜魚為冰凍的藍(lán)圓鲹Decapterus maruadsi，俗名池魚。A、B 兩種人工配合飼料的魚油添加量分別為6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)和12%，面粉添加量分別為20%、14%，其余原料均為進(jìn)口魚粉42%、國(guó)產(chǎn)魚粉10%、豆粕15%、復(fù)合維生素1%、復(fù)合礦物質(zhì)4%、烏賊膏2%，將各原料充分混勻，用制粒機(jī)制成直徑為4.5 mm 的顆粒飼料，制粒溫度為40 ～45 ℃，自然風(fēng)干，過篩后于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩＝?jīng)測(cè)定，A、B 兩種配合飼料和冰鮮雜魚的粗脂肪含量分別為8.2%、14.5%和4.4%，占各飼料干質(zhì)量的8.9%、15.7%和12.3%(表1)。

表1 各組飼料營(yíng)養(yǎng)組分Tab.1 Approximate composition of the test diets w/%

1.2.2 飼養(yǎng)管理 選擇健康的大口黑鱸270 尾，隨機(jī)分為3 組，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，分別放入已消毒的水泥池(8 m3)中養(yǎng)殖，每池30 尾。3 組分別喂食冰鮮雜魚、A 配合飼料和B 配合飼料。養(yǎng)殖條件相同，飼料用水均為充分曝氣的自來水，每?jī)商爝M(jìn)行一次排污，測(cè)量水溫和pH 值，并根據(jù)水質(zhì)的具體情況換30% ～50%的曝氣水，每日上、下午各投喂1次，少量投餌，喂食至魚不再搶食為止，飼養(yǎng)試驗(yàn)共進(jìn)行3 個(gè)月。試驗(yàn)過程中計(jì)算試驗(yàn)魚的存活率，測(cè)量每組魚的初始平均體質(zhì)量(W0)和終末平均體質(zhì)量(Wt)，并按下式計(jì)算［9-10］:

1.2.3 肝臟中兩種LPL mRNA表達(dá)量的檢測(cè) 飼養(yǎng)結(jié)束后，停食24 h。從對(duì)照組和試驗(yàn)組分別取6尾大口黑鱸，用MS222 麻醉，取其肝臟，用TRIzol(Invitrogen，USA)快速提取肝臟總RNA。以18S作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物(表2)，用ABI 7300 型熒光定量PCR 儀檢測(cè)大口黑鱸LPLtype1和LPLtype2 mRNA在各組大口黑鱸肝臟中的表達(dá)量。熒光定量所得數(shù)據(jù)，用2-△△CT法計(jì)算LPL 基因的相對(duì)表達(dá)量，用Excel 軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。

表2 引物序列Tab.2 Primers in the study

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)的影響

從表3可見:喂食冰鮮雜魚的對(duì)照組大口黑鱸的平均體質(zhì)量增加率最大，為139.15%，與喂食B配合飼料和A 配合飼料的組存在顯著性差異(P＜0.05)，喂食冰鮮雜魚組的大口黑鱸生長(zhǎng)速度明顯快于喂食人工配合飼料的魚。

表3 飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸存活率和生長(zhǎng)速度的影響Tab.3 Effcets of dietary lipid levels on survival and growth rate of large mouthbass Micropterus salmoide

解剖各組大口黑鱸取其肝臟組織觀察發(fā)現(xiàn)，喂食配合飼料的大口黑鱸肝臟出現(xiàn)不同程度的病變，表現(xiàn)為肝臟腫大，色澤變淡，外表無光澤，嚴(yán)重的魚體內(nèi)脾已為黑褐色。飼養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)，喂食配合飼料的大口黑鱸食欲不振，游動(dòng)緩慢。

2.2 飼料脂肪水平對(duì)大口黑鱸肝臟中LPLtype1 mRNA、LPLtype2 mRNA表達(dá)量的影響

從圖1可見，大口黑鱸肝臟中LPLtype1 mRNA與LPLtype2 mRNA 的表達(dá)相似，均為喂食高脂肪含量的B 配合飼料組魚的肝臟中表達(dá)量最高，與喂食冰鮮雜魚和A 配合飼料的組存在顯著性差異(P＜0.05)(圖1)。

圖1 試驗(yàn)各組大口黑鱸肝臟中LPLtype1、LPLtype2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression levels of large mouth bass LPLtype1，and LPLtype2 mRNA in livers of large mouthbass Micropterus salmoide in the experiment

3 討論

本試驗(yàn)中，喂食冰鮮雜魚的對(duì)照組大口黑鱸的平均體質(zhì)量增加率明顯高于喂食兩種配合飼料的魚，且喂食配合飼料的大口黑鱸肝臟出現(xiàn)不同程度的病變，表現(xiàn)出食欲不振，游動(dòng)緩慢等現(xiàn)象，說明大口黑鱸這種肉食性養(yǎng)殖魚類對(duì)人工配合飼料還沒有形成很好的適應(yīng)性。關(guān)勝軍等［11］對(duì)大口黑鱸投喂人工配合軟飼料和冰鮮雜魚的生長(zhǎng)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果也表明，從投喂第20天開始，喂食冰鮮雜魚的大口黑鱸體質(zhì)量顯著高于喂食人工配合飼料的魚，與本研究結(jié)果相似。冰鮮雜魚中的粗脂肪含量占到了飼料干質(zhì)量的12.3%，但由于其中各種脂肪和蛋白質(zhì)所占的比例或其結(jié)合形式，易于被魚類所吸收，所以不影響肉食性魚類的健康生長(zhǎng)。人工配合飼料雖然營(yíng)養(yǎng)豐富，但與天然餌料相比其營(yíng)養(yǎng)成分存在較大差異，而大口黑鱸對(duì)人工配合飼料還未形成很好的適應(yīng)性，所以人工配合飼料影響了魚體的健康生長(zhǎng)，使其生長(zhǎng)速度減慢。但也有學(xué)者認(rèn)為，人工配合飼料對(duì)肉食性水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)沒有顯著影響［12-13］，這可能是由于養(yǎng)殖種類的不同，以及人工配合飼料適口性的差異和水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)人工配合飼料適應(yīng)性的差異造成試驗(yàn)結(jié)果的不同。

大口黑鱸脂蛋白脂肪酶LPLtype1和LPLtype2基因在喂食配合飼料與喂食冰鮮雜魚時(shí)相比，在肝臟出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)，且在喂食脂肪含量最高的B配合飼料組大口黑鱸肝臟中表達(dá)量最高，與喂食冰鮮雜魚組和低脂肪飼料A 組有顯著性差異，說明本研究中的兩種人工配合飼料，特別是B 配合飼料中的脂肪含量已明顯高于大口黑鱸對(duì)脂肪的需求量，而魚體吸收的多余脂肪被貯存在魚類最主要的營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)性貯脂部位肝臟中，脂蛋白脂肪酶是脂肪代謝的關(guān)鍵酶，在分解肝臟內(nèi)多余的脂肪中起重要作用［14-15］，其表達(dá)受飼料中脂肪含量的調(diào)節(jié)。有研究表明，真鯛Pagrosomus major 的LPL 基因在肝臟也存在營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)性表達(dá)［16］，饑餓、高脂食物均是其表達(dá)誘導(dǎo)因子。楊奇慧等［17］也發(fā)現(xiàn)，喂食配合飼料的軍曹魚Rachycentron canadum 肝臟脂肪酶活性明顯比喂食冰鮮魚時(shí)高。Panserat等［18］采用cDNA Microarray 技術(shù)分析了用不同脂肪水平的飼料飼喂虹鱒Oncorhynchus mykiss 后其肝臟組織基因表達(dá)變化的情況，發(fā)現(xiàn)飼料脂肪水平誘導(dǎo)了虹蹲41 個(gè)肝臟基因的表達(dá)發(fā)生變化，其中包括脂蛋白脂肪酶基因的上調(diào)表達(dá)。

本試驗(yàn)中，喂食低脂肪和高脂肪配合飼料的試驗(yàn)魚肝臟中LPLtype1 mRNA表達(dá)量分別是對(duì)照組魚的1.3 倍和3.0 倍，而LPLtype2 mRNA表達(dá)量分別是對(duì)照組魚的1.7 倍和3.0 倍。這說明LPLtype1與LPLtype2 兩個(gè)基因具有相似的功能，且LPLtype2 基因?qū)︼暳现械闹竞扛鼮槊舾?，更易受飼料中高脂肪含量的調(diào)節(jié)。氨基酸序列分析表明，大口黑鱸LPLtype1 與LPLtype2 之間的同源性為43.5%，LPLtype2 氨基酸序列比LPLtype1 少119個(gè)，主要表現(xiàn)為N 端部分序列缺失，但主要功能域仍保留著［4］。在大馬哈魚卵巢中也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)LPL 基因，分別被命名為L(zhǎng)PL1和LPL2，其氨基酸同源性僅為31%，在卵巢中，LPL1 mRNA表達(dá)量在4月份出現(xiàn)一個(gè)明顯峰值，而LPL2 mRNA表達(dá)量在6月份出現(xiàn)一個(gè)明顯峰值，推測(cè)脂蛋白脂肪酶基因也調(diào)節(jié)著卵巢成熟的季節(jié)變化發(fā)育，并可能存在一定的功能分工［19］。

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