多子小瓜蟲HSP70 基因ORF 的克隆及表達(dá)分析

夏潤林，潘厚軍，趙飛，方翔，石存斌，李華，吳淑勤

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510380)

多子小瓜蟲Ichthyophthirius multifiliis是一種能感染淡水魚類的重要纖毛蟲，主要寄生于魚的體表和鰓，引起“白點(diǎn)病”，對(duì)魚的種類及年齡均無嚴(yán)格選擇性，分布很廣，在世界范圍內(nèi)能引起養(yǎng)殖魚類大量死亡，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和觀賞魚貿(mào)易中可造成重大經(jīng)濟(jì)損失［1-3］。多子小瓜蟲的生活史分成感染性幼蟲、寄生的滋養(yǎng)體和繁殖的包囊三個(gè)階段［4］，其幼蟲階段和包囊階段都是在水體中完成，因此，水溫是其生存和繁衍后代最重要的因素之一。水溫的變化對(duì)多子小瓜蟲的包囊孵化［5］、幼蟲活力［5］、感染率［6］和繁殖率［7］都有一定的影響。多數(shù)研究者［8-11］認(rèn)為，小瓜蟲病適宜發(fā)生的水溫為15 ～25℃，當(dāng)水溫在30 ℃左右時(shí)，多子小瓜蟲包囊的存活率僅約10%，而且包囊都不能孵化［5］，因而在多子小瓜蟲的防控實(shí)踐中，有將水溫調(diào)高到28 ℃以上防治小瓜蟲的報(bào)道［12-14］。也有研究者發(fā)現(xiàn)，水溫在26 ～29 ℃時(shí)，小瓜蟲病依然發(fā)生，并能感染淡水魚［15］。筆者最近在養(yǎng)殖的過程中亦發(fā)現(xiàn)，在30 ℃左右水溫時(shí)多子小瓜蟲仍能大量感染草魚。因此，揭示在高溫環(huán)境中多子小瓜蟲感染和存活的生理機(jī)制成為寄生蟲防治中迫切需要解決的問題。張其中等［5］研究表明，水溫在4 ℃左右或28 ～32℃時(shí)，多子小瓜蟲都不能孵化，但有少部分蟲體以包囊形式存活下來，推測當(dāng)溫度降到適宜時(shí)，包囊能孵化為幼蟲，成為再次暴發(fā)小瓜蟲病的根源。但多子小瓜蟲高溫應(yīng)激的分子機(jī)制目前尚未見報(bào)道。

熱激蛋白(Heat-shock proteins，HSPs)是生物適應(yīng)環(huán)境溫度變化的重要媒介分子，過高或過低的溫度都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞或機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，迅速合成HSP，并作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解等過程，以維持細(xì)胞蛋白自穩(wěn)，提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的耐受性，增強(qiáng)抗氧化作用，使細(xì)胞維持正常的生理功能［16-17］。HSP70 為HSPs 中最保守、最重要的一簇，其在大多數(shù)生物中含量較多，在應(yīng)激反應(yīng)中最敏感［18］，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［19-20］、細(xì)胞衰老［21-22］和生育［23］過程中均起著重要的作用。研究表明，環(huán)境溫度升高時(shí)，可以增強(qiáng)HSP70 基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的存活，抑制細(xì)胞凋亡［24］。當(dāng)溫度升高時(shí)，嗜熱四膜蟲Tetrahymena thermophila在生長、饑餓和接合生殖等生理或發(fā)育狀態(tài)下，HSP70 基因的表達(dá)水平隨溫度的升高而增加［17］。同樣，可用HSP70 檢測不同地域生物的耐熱能力［16］。選用保守的HSP70 作為分子標(biāo)記來研究同種生物在不同溫度誘導(dǎo)下的表達(dá)變化規(guī)律，可以更好地認(rèn)識(shí)物種耐熱的機(jī)制。本研究中，克隆了寄生于草魚的多子小瓜蟲HSP70 基因(Im HSP70)的開放閱讀框(ORF)，并研究了在3種不同溫度下多子小瓜蟲HSP70 基因在幼蟲、滋養(yǎng)體和包囊3 個(gè)不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，旨在為從分子水平探討多子小瓜蟲的溫度適應(yīng)機(jī)理提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 多子小瓜蟲來源 寄生有多子小瓜蟲的草魚Ctenopharynodon idellus 取自廣東省清遠(yuǎn)市某草魚苗種場，苗種場養(yǎng)殖水溫為(29 ±3)℃，草魚體長為(8.5 ±0.53)cm，體質(zhì)量為(13.35 ±2.51)g。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后暫養(yǎng)于用活性碳除氯后的自來水中，水溫為(25 ±1)℃。

1.1.2 試驗(yàn)魚 RR -B 系劍尾魚Xiphophorus hellerii 體長為(5.64 ±0.41)cm，體質(zhì)量為(6.05±2.12)g，取自珠江水產(chǎn)研究所水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將108 尾試驗(yàn)魚平均分為9 組，暫養(yǎng)于9 個(gè)0.1 m3的小池中，暫養(yǎng)用水為除氯后的自來水，適應(yīng)5 d 后，再與寄生有多子小瓜蟲的草魚，在不同溫度(20 ±1)、(25 ±1)、(30 ±1)℃的水中混養(yǎng)，每個(gè)溫度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)中將12 尾劍尾魚和2 尾攜帶多子小瓜蟲的草魚混養(yǎng)在一起。

1.2.2 不同溫度下多子小瓜蟲成蟲、包囊和幼蟲的獲得 取被多子小瓜蟲嚴(yán)重感染的劍尾魚(體表有很多的白點(diǎn))，輕輕刮魚體表面，將一定量的水連同多子小瓜蟲滋養(yǎng)體倒入培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，用吸管將集聚在中央的滋養(yǎng)體吸到另一個(gè)培養(yǎng)皿中，用蒸餾水反復(fù)清洗3次，直至除去大部分黏液。將滋養(yǎng)體移入裝有滅菌蒸餾水的離心管中，參照張其中等［5］的方法，將收集的滋養(yǎng)體分別在(20 ±1)、(25 ±1)、(30 ±1)℃恒溫中培育，形成包囊和孵化出幼蟲。

1.2.3 總RNA 的提取及cDNA 的合成 分別將不同溫度下得到的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體、幼蟲和包囊富集于離心管底部，每個(gè)樣品加入1 mL 的TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，于-70 ℃下保存。參照TRIzol Reagent 說明書對(duì)保存的樣品進(jìn)行總RNA的提取，用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的完整性，用分光光度計(jì)檢測其濃度和純度，將高質(zhì)量的總RNA 于-70 ℃下保存?zhèn)溆?。? μg 總RNA，通過Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(Roche，Germany)合成cDNA 第一鏈。分別將GenBank 中已報(bào)道的纖毛類嗜熱四膜蟲T.thermophila(GenBank:JQ697041)、螅狀獨(dú)縮蟲 Carchesium polypinum(GenBank:AY561304)HSP70 的mRNA 序列在多子小瓜蟲基因組數(shù)據(jù)庫ImDB(www.ich.ciliate.org/blast/)中進(jìn)行Blast 比對(duì)，找到同源序列，再把獲得的序列通過NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進(jìn)行再次比對(duì)確認(rèn)，得到多子小瓜蟲HSP70 的預(yù)測基因序列。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物F1、R1(表1)，用PCR 擴(kuò)增HSP70 基因的ORF，擴(kuò)增產(chǎn)物通過E.Z.N.A.TM Gel Extraction kit 試劑盒(Omega 公司)純化回收，連接到pGM -T18 載體(TaKaRa公司)中，轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取3 個(gè)陽性克隆，送上海生物工程有限公司測序。

1.2.4 序列分析用Blast程 序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索。使用在線軟件SMART(http://smart.embl- heidelberg.de/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能域分析。經(jīng)Predictprotein(https://www.predictprotein.org/)在線預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用Swiss - model(http://swissmodel.expasy.org/)服務(wù)器預(yù)測3 -D 結(jié)構(gòu)。使用Clustal W軟件將克隆的多子小瓜蟲及其他物種HSP70 基因的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，用Mega 4.1 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 熒光定量RT -PCR 利用Beacon Designer 8.0 軟件設(shè)計(jì)HSP70 特異引物F、R(表1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，以18S RNA 作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物為IMR - F1、IMR - R1［4］(表1)，用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測各基因在各樣品中的表達(dá)量。反應(yīng)體系(20 μL):10 μL SYBR?Premix Ex TapTM(TaKaRa 公司)，0.4 μL ROX Reference Dye(TaKaRa 公司)，引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序:95 ℃下預(yù)變性10 min;95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán);最后在95 ℃下反應(yīng)15 s，60 ℃下反應(yīng)30 s，95 ℃下反應(yīng)15 s。

表1 引物序列信息Tab.1 Sequences of primers used in this experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

以各溫度下幼蟲、滋養(yǎng)體和包囊的cDNA 為樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀7300 測定目的基因的豐度，應(yīng)用2-△△CT分析方法，通過ABI7300 系統(tǒng)初步統(tǒng)計(jì)，用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多子小瓜蟲HSP70 基因ORF 序列分析

以多子小瓜蟲滋養(yǎng)體cDNA 為模板，采用引物F1和R1，PCR 擴(kuò)增得到一條1995 bp 的條帶，符合預(yù)期大小。經(jīng)Blast 比對(duì)及ORF 分析后，確認(rèn)該序列為多子小瓜蟲HSP70 其因的ORF(GenBank登錄號(hào):KF626379);將其與多子小瓜蟲基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Im HSP70 無內(nèi)含子，ORF 全長為1995 bp，預(yù)測編碼為664 個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量為72 510，等電點(diǎn)為5.42。正電荷殘基(Arg+Lys)85 個(gè)，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)112個(gè)，整個(gè)蛋白質(zhì)帶-27 價(jià)電荷，為膜外蛋白。

經(jīng)Predictprotein 分析，Im HSP70 的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α- 螺旋和無規(guī)卷曲為主(圖1);經(jīng)Swiss -model 及SMART 分析，Im HSP70 蛋白的空間結(jié)構(gòu)在N 端含有一個(gè)高度保守的ATP 酶功能域，在C 端含有一個(gè)高度保守的多肽結(jié)合功能域(圖2、圖3)。

圖1 Im HSP70 蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.1 The deduced secondary structure of the HSP70 from Ichthyophthirius multifiliis

圖2 Im HSP70 蛋白分子功能域預(yù)測圖Fig.2 The deduced domains of the HSP70 from I.multifiliis

圖3 Im HSP70 蛋白分子三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.3 Tertiary structure of the deduced HSP70 from I.multifiliis

2.2 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將得到的氨基酸序列與GenBank 中其他寄生蟲比較，并通過軟件Clustal W 計(jì)算同源性。結(jié)果顯示，Im HSP70 與其他物種的相似性為54.94% ～78.08%(表2)，其中與螅狀獨(dú)縮蟲相似性最高(78.08%)。將上述比對(duì)結(jié)果采用NJ 法重復(fù)1000次構(gòu)建bootstrap 驗(yàn)證的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果顯示:哺乳類、兩棲類、爬行類、鳥類聚為一個(gè)分支;無脊椎動(dòng)物果蠅(NP_ 731651)、旋毛形線蟲(AAO63753)等聚為另外一個(gè)分支;纖毛類的螅狀獨(dú)縮蟲(AAS68531)、多子小瓜蟲(Im HSP70)、嗜熱四膜蟲(AAK29100)、變蘚棘毛蟲(AED86994)聚為一個(gè)分支。

表2 Im HSP70 氨基酸序列與其他物種的相似性Tab.2 Identity of HSP70 amino acid in Ichthyophthirius multifiliis with other species

2.3 不同溫度下Im HSP70 mRNA在不同發(fā)育階段相對(duì)表達(dá)水平的比較

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法，分析溫度為20、25、30 ℃時(shí)多子小瓜蟲HSP70 基因在3 個(gè)不同發(fā)育階段(幼蟲、滋養(yǎng)體和包囊)的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:20 ℃和25 ℃時(shí)，Im HSP70 基因在滋養(yǎng)體中的表達(dá)量最高，且顯著高于其他兩個(gè)階段(P＜0.05)，包囊中表達(dá)量次之，幼蟲中表達(dá)量最低;30 ℃時(shí)，Im HSP70 基因在包囊中的表達(dá)量最高，且顯著高于其他兩個(gè)階段(P＜0.05)，滋養(yǎng)體中次之，幼蟲中最低(圖5)。3 個(gè)發(fā)育階段中，表達(dá)量最大的是25 ℃時(shí)滋養(yǎng)體，分別是25 ℃時(shí)幼蟲、包囊中表達(dá)量的179 倍和54 倍。

分別對(duì)多子小瓜蟲幼蟲、滋養(yǎng)體和包囊在20、25和30 ℃時(shí)的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明:幼蟲中HSP70 基因在30 ℃時(shí)表達(dá)略有增強(qiáng)(P ＞0.05)，分別是25 ℃和20 ℃時(shí)的1.75 倍和1.28倍;滋養(yǎng)體中HSP70 的表達(dá)量在25 ℃時(shí)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，在30 ℃時(shí)又顯著降低(P＜0.05)，呈先升后降的變化趨勢;包囊中HSP70 的表達(dá)量呈先降后升的變化趨勢，在25 ℃時(shí)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，30 ℃時(shí)表達(dá)量又顯著升高(P＜0.05)。

圖4 Im HSP70 與其他物種HSP70 基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of HSP70 from I.multifiliis and other species

圖5 小瓜蟲不同發(fā)育階段HSP70 mRNA在不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of Im HSP70 mRNA in different stages of I.multifiliis at different temperature

3 討論

3.1 多子小瓜蟲HSP70 基因序列與結(jié)構(gòu)特征

有研究表明，HSP70可能是寄生蟲-宿主相互作用的一個(gè)重要的分子［25］。HSP70 的存在，可以促進(jìn)感染的宿主細(xì)胞成為自然殺傷細(xì)胞(NK -cell)介導(dǎo)毒性的靶細(xì)胞［26］。HSP70 家族中，共有21種蛋白質(zhì)，主要包括誘導(dǎo)型HSP70、熱激同源蛋白70(heat shock cognate 70，HSC70)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75等［27］，其中誘導(dǎo)型HSP70 基因的一個(gè)顯著特征是不含內(nèi)含子［28］。用本研究中克隆得到的多子小瓜蟲HSP70 基因的ORF 與多子小瓜蟲基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，多子小瓜蟲HSP70 基因不含內(nèi)含子，克隆出來的可能屬于誘導(dǎo)型HSP70 基因。馮立芳等［17］克隆出嗜熱四膜蟲的HSP70 基因，明建華等［29］克隆出團(tuán)頭魴的HSP70 基因，均驗(yàn)證了這個(gè)特征。Im HSP70 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和β -折疊為主，這與脊椎動(dòng)物的HSP70 相似［30］。同源性分析表明，多子小瓜蟲HSP70 與其他原生動(dòng)物HSP70 的氨基酸序列相似性高，與同為纖毛門的螅狀獨(dú)縮蟲、嗜熱四膜蟲、變蘚棘毛蟲聚在一個(gè)分支上，而與哺乳類、鳥類等相距甚遠(yuǎn)，說明根據(jù)HSP70 序列分析的結(jié)果與傳統(tǒng)的分類結(jié)果是一致的。而馮立芳等［17］克隆出嗜熱四膜蟲的5 個(gè)HSP70，編碼序列各不相同。Raphaela等［31］分析發(fā)現(xiàn)，HSP70 家族中有著不同的基因型成員，說明HSP70 具有多態(tài)性，而且在功能上也是有差異的。多子小瓜蟲HSP70是否存在其他的類型，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 多子小瓜蟲HSP70 基因表達(dá)與發(fā)育、溫度的相關(guān)性

多數(shù)寄生蟲生活史復(fù)雜，具有不同的發(fā)育階段。HSP70 基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)量是否有差異，也是揭示寄生蟲抵抗不同環(huán)境條件而生存的關(guān)鍵。前人的研究表明，在寄生蟲的不同發(fā)育階段，HSP70 的表達(dá)存在差異。del Cacho等［32］對(duì)柔嫩艾美耳球蟲Eimeria tenella 的研究發(fā)現(xiàn)，在球蟲的發(fā)育、成熟和入侵過程中，孢子生殖階段的HSP70表達(dá)量呈遞增水平，利用HSP70 的特異性單克隆抗體通過免疫組化等技術(shù)分析顯示，HSP70表達(dá)于孢子形成階段;HSP70 出現(xiàn)在早期感染階段可能與蟲體在宿主體內(nèi)受到的應(yīng)激有關(guān)，也可能與子孢子的形成有關(guān)。Neumann等［33］對(duì)曼氏血吸蟲Schistosoma mansoni在不同發(fā)育階段的HSP70 研究發(fā)現(xiàn)，HSP70 只表達(dá)于胞蚴、童蟲和成蟲，在尾蚴中不表達(dá)，在胞蚴和尾蚴的轉(zhuǎn)型期HSP70 轉(zhuǎn)錄終止;但尾蚴轉(zhuǎn)化為童蟲和成蟲受42 ℃熱應(yīng)激處理后，HSP70表達(dá)升高，6 h 達(dá)到最高水平。馮立芳等［17］的研究也發(fā)現(xiàn)，嗜熱四膜蟲在生長、饑餓和接合生殖等生理或發(fā)育狀態(tài)下，HSP70 的表達(dá)量也是不同的。與其結(jié)果相似的是，本研究中通過對(duì)3種不同溫度下，HSP70 mRNA在多子小瓜蟲3 個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，在幼蟲、包囊和成蟲3 個(gè)發(fā)育階段，HSP70表達(dá)量有顯著的差異，而且在幼蟲階段表達(dá)量最低。Abernathy等［34］利用多子小瓜蟲表達(dá)序列標(biāo)簽信息比較發(fā)現(xiàn)，多子小瓜蟲在幼蟲、滋養(yǎng)體、包囊的轉(zhuǎn)錄因子包括抑動(dòng)抗原和表質(zhì)蛋白均表達(dá)不同。Yi等［35］發(fā)現(xiàn)，木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis和槐屬植物苦豆子Sophora alopecuroides 的甲醇提取物對(duì)小瓜蟲幼蟲有著很強(qiáng)的殺滅活性，且提取物對(duì)幼蟲階段的毒力要顯著強(qiáng)于包囊階段;Ling等［36］也得出同樣的結(jié)論。本研究結(jié)果表明，多子小瓜蟲HSP70在幼蟲階段的表達(dá)量最低，可能與不同生活史階段有關(guān)。

多子小瓜蟲對(duì)溫度的耐受性存在著明顯的差異，分為溫帶型和熱帶型［7］，溫帶型的適宜水溫為16 ℃，熱帶型的適宜水溫在16 ～24 ℃。馮立芳等［16］在研究螅狀獨(dú)縮蟲的耐熱能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同緯度地域的螅狀獨(dú)縮蟲，其HSP70 高表達(dá)的閥值也是不同的。本研究中，多子小瓜蟲取自水溫為29 ℃下的感染草魚，這表明多子小瓜蟲在29 ℃時(shí)仍對(duì)草魚具有致病性，故推測該多子小瓜蟲為熱帶型。del Cacho等［37］對(duì)柔嫩艾美耳球蟲Eimeria tenella 野生株和2種早熟株的子孢子階段的HSP70表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，隨著蟲株毒力的減弱其子孢子的HSP70表達(dá)水平呈遞減趨勢，表明HSP70在柔嫩艾美耳球蟲子孢子中的表達(dá)與其致病性相關(guān)。HSP70在不同的生物中作為一種抗應(yīng)激相關(guān)因子，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，以合成表達(dá)HSP70 來提高自身的抵抗力。本研究中，劍尾魚在30 ℃水溫中仍能感染多子小瓜蟲病，可能與多子小瓜蟲高表達(dá)的HSP70 有一定的關(guān)系。隨著孵育溫度的升高，在滋養(yǎng)體中的表達(dá)量先上升后降低，在包囊中的表達(dá)量先降低后上升。多子小瓜蟲受到熱刺激時(shí)，HSP70 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平隨之出現(xiàn)明顯的增加。而當(dāng)熱刺激超過HSP70 蛋白的耐受能力范圍時(shí)，高HSP70 的表達(dá)量可能反饋調(diào)節(jié)抑制HSP70 基因的表達(dá)［38］。多子小瓜蟲的幼蟲和包囊階段是生活在水體中，包囊的形成是多子小瓜蟲對(duì)不良環(huán)境的一種很好的適應(yīng)性，而幼蟲卻沒有這種保護(hù)機(jī)制，這也可能是包囊與幼蟲HSP70表達(dá)量不同的原因之一。水溫30℃時(shí)，滋養(yǎng)體中HSP70 也有一定的表達(dá)量，說明在30 ℃時(shí)多子小瓜蟲滋養(yǎng)體仍具有生物活性。而在包囊中HSP70表達(dá)量顯著高于滋養(yǎng)體和幼蟲，說明包囊的形成有利于抵抗高溫的環(huán)境。HSP70在包囊中的大量表達(dá)也許是多子小瓜蟲病在大約30℃的高溫時(shí)仍能暴發(fā)的重要分子機(jī)制。因此，有必要對(duì)不同溫度型的多子小瓜蟲在不同溫度下以及不同型HSP70在耐熱機(jī)制中的功能作進(jìn)一步探討。

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