副豬嗜血桿菌河南分離株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

董永軍，王麗榮，趙俊江

（1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

副豬嗜血桿菌(HPS) 是一種多形態(tài)、非溶血性、不運(yùn)動(dòng)、NAD 依賴型、革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，屬于巴斯德桿菌科嗜血桿菌屬。副豬嗜血桿菌只感染豬，有很強(qiáng)的宿主特異性，可以影響2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后保育舍階段發(fā)病，感染高峰通常見于保育期的4～6周，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)50%[1]。副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的一種以急性敗血癥、多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的細(xì)菌性傳染病。該病為繼發(fā)性疾病，常在藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒等病毒感染后激發(fā)帶菌豬和慢性感染豬發(fā)病，成為本病的傳染源，病原菌主要存在于豬的上呼吸道，通過豬之間的接觸、空氣飛沫及污染物而傳播[2]。在集約化豬場中，當(dāng)豬群遭受環(huán)境不良、轉(zhuǎn)群、去勢、免疫注射、飼養(yǎng)不當(dāng)?shù)葢?yīng)激因素影響， 或者豬群感染豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性疾病時(shí)， 副豬嗜血桿菌病伺機(jī)暴發(fā)， 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前， 該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病。

在特定的條件下引起豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，主要臨床癥狀為發(fā)熱、食欲不振、厭食、反應(yīng)遲鈍、咳嗽、呼吸困難、疼痛(尖叫)、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、顫抖、共濟(jì)失調(diào)，可視黏膜發(fā)紺、側(cè)臥、消瘦和被毛凌亂隨之可能死亡。種豬急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)，公豬慢性跛行[4]。特征性病理變化為胸腔、腹腔漿膜及肺部炎癥，胸腔內(nèi)有大量的淡紅液體及纖維素性滲出物。肺表面覆蓋有大量的纖維素性滲出物并與胸壁粘連，多數(shù)為間質(zhì)性肺炎，部分有對稱性肉變。各臟器有不同程度的出血、淤血和壞死。鏡檢滲出物中有大量纖維蛋白、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞。實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的顆粒變性、水泡變性和壞死，實(shí)質(zhì)和間質(zhì)可見充血、出血、炎性細(xì)胞浸潤、纖維性滲出和水腫液蓄積[5]。

近年來，副豬嗜血桿菌病在國內(nèi)豬場引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報(bào)道屢見不鮮，其發(fā)病率和死亡率日漸升高。為此，本實(shí)驗(yàn)對河南省內(nèi)疑似病例進(jìn)行病原分離培養(yǎng)，以對本病藥物防控中藥敏檢測及其滅活菌苗研制奠定基礎(chǔ)；本實(shí)驗(yàn)還采用病原學(xué)和生化鑒定診斷， 并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)， 以期為該病的診治提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集

對河南某豬場的15頭疑似副豬嗜血桿菌感染的病仔豬進(jìn)行病理剖檢。無菌條件下抽取心血、心包液和腹水，并采集病變明顯的肺、心、腎臟等病料進(jìn)行病原學(xué)檢查。

1.1.2 菌種與主要培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌，各種藥敏試紙片（左旋氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、乳酸環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀等）；煙酰胺嘌呤二核苷酸、美蘭染色、革蘭氏染色、HE染色試劑，普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基、綿羊鮮血瓊脂平板、加NAD的巧克力瓊脂平板和TSA培養(yǎng)基、TSB 液體培養(yǎng)基均自制。

1.1.3 生化鑒定微量發(fā)酵管及試劑

葡萄糖發(fā)酵管、蔗糖發(fā)酵管、甘露糖發(fā)酵管、木糖發(fā)酵管、棉籽糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、硫化氫微量發(fā)酵管，氧化酶、3%過氧化氫、硝酸鹽培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌操作條件下， 采集病豬的心血、心包液、腹水、肺、心、腎臟等病料，首先劃線接種于含NAD的巧克力瓊脂平板或TSA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，然后挑取單個(gè)菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)[6]。

1.2.2 染色鏡檢

將培養(yǎng)后的單個(gè)疑似菌落涂片， 進(jìn)行美蘭染色和革蘭氏染色， 鏡檢，觀察菌體形態(tài)及染色特性。

1.2.3 培養(yǎng)特性

取疑似副豬嗜血桿菌菌落分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基、綿羊鮮血瓊脂平板、含NAD巧克力瓊脂平板和TSA培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h， 觀察菌落的生長情況。

1.2.4 生化鑒定

糖類分解試驗(yàn)：取純培養(yǎng)后的細(xì)菌分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管內(nèi)，倒置于潔凈的小燒杯內(nèi)，置滅菌培養(yǎng)皿中。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果判斷：無變化，培養(yǎng)液仍為紫色，陰性反應(yīng)；產(chǎn)酸，培養(yǎng)液為黃色及產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，培養(yǎng)液變黃，并有氣泡，陽性反應(yīng)。

硫化氫試驗(yàn)：取純培養(yǎng)的細(xì)菌接種于硫化氫微量發(fā)酵管，置于37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察，培養(yǎng)液黑色者為陽性，無色者為陰性[7]。

氧化酶試驗(yàn)：加2～3滴試劑于濾紙上，用牙簽挑取1個(gè)菌落到紙上涂布， 觀察菌落反應(yīng)。陽性反應(yīng)在5～10 s內(nèi)由粉色到黑色，15 min后可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。也可以將試劑滴在細(xì)菌的菌落上，菌落成玫瑰紅然后到深紫色者為陽性。

觸酶試驗(yàn)：可用接種環(huán)將菌落放于載玻片的中央，加1滴3%過氧化氫于菌落上，立即觀察有無氣泡出現(xiàn)；也可以直接將3%過氧化氫滴加到菌落上觀察有無氣泡出現(xiàn)。

硝酸鹽還原試驗(yàn)：把純菌接種到硝酸鹽培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)18～24 h，再加試劑甲（對氨基苯磺酸0.8 g+5 mol/L醋酸100 mL）和乙（α-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸100 mL）各3～5滴，在30 s內(nèi)出現(xiàn)紅色即為陽性。若無顏色出現(xiàn)，加少量鋅渣，隨后出現(xiàn)紅色則是真正的陰性試驗(yàn)。[8]

1.2.5 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察

挑取經(jīng)純化培養(yǎng)的可疑菌落，于綿羊鮮血瓊脂平板上水平畫線，再挑取金黃色葡萄球菌垂直劃線，37 ℃培養(yǎng)24～48 h， 觀察是否有衛(wèi)星生長現(xiàn)象。

1.2.6 動(dòng)物試驗(yàn)

將純化菌接種于TSB 液體培養(yǎng)基，18 h后經(jīng)菌落計(jì)數(shù)，將培養(yǎng)液稀釋成每毫升含2×105個(gè)菌，皮下注射0.2 mL稀釋液于小白鼠。

1.2.7 藥敏試驗(yàn)

將培養(yǎng)純化的菌種均勻涂布于含NAD的巧克力培養(yǎng)基上，然后按常規(guī)紙片法，將各種藥敏試紙片（左旋氧氟沙星、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、乳酸環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀等）貼于平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈大小。

判定標(biāo)準(zhǔn)： 抑菌圈直徑大于15 mm 為高度敏感；抑菌圈直徑在10～15 mm之間為中度敏感；抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

分離到3株細(xì)菌，分別命名為HPS 1、HPS 2、HPS 3。

表1 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 染色鏡檢

革蘭氏染色陰性，多呈短桿狀，有的呈球桿狀，出現(xiàn)急性敗血癥的病豬血涂片美蘭染色可見大量細(xì)菌，符合副豬嗜血桿菌的菌落和細(xì)菌形態(tài)[10]。

2.3 培養(yǎng)特性觀察

3株細(xì)菌在普通瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基上均不生長，在含NAD巧克力培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基上呈光滑、無色透明或灰白色半透明、露珠狀、扁平的小菌落。

2.4 生化鑒定結(jié)果

3個(gè)菌株均發(fā)酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖，但不發(fā)酵甘露醇和木糖，棉籽糖不穩(wěn)定(HPS 1為陽性，其余為陰性)，硫化氫試驗(yàn)呈陰性，氧化酶試驗(yàn)呈陰性，觸酶試驗(yàn)呈陽性，硝酸鹽試驗(yàn)呈陽性。所分離細(xì)菌鑒定結(jié)果均符合副豬嗜血桿菌的生化特性[11]。

2.5 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察

在金黃色葡萄球菌線兩側(cè)有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，呈現(xiàn)出典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”并且不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，證明此菌為依賴NAD生長的細(xì)菌。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

56 h后小白鼠出現(xiàn)毛松、呆滯等癥狀。68 h后小白鼠出現(xiàn)死亡。從死亡的小白鼠回收到原病原菌。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，分離菌株對左旋氧氟沙星均高敏，對恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉全部敏感，對替米考星、阿莫西林、鹽酸林可霉素、氨芐西林、青霉素鉀均不敏感或耐藥，對乳酸環(huán)丙沙星、克林霉素、硫酸慶大霉素、氟哌酸等藥物敏感性表現(xiàn)不一。

3 討論

副豬嗜血桿菌曾被認(rèn)為是一種隨機(jī)入侵的次要病原，在與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌等協(xié)同作用時(shí)才引發(fā)臨床癥狀[12]。目前在獸醫(yī)臨床上副豬嗜血桿菌病已經(jīng)變成一種常見的、可獨(dú)立發(fā)生的疾病。本試驗(yàn)在分離病原時(shí)，對發(fā)熱期病豬采集耳緣靜脈或前腔靜脈的血液； 病豬死后，采集心血、心包液、胸水、腹水、纖維蛋白性滲出物、肺臟和肝臟等作為病料，在患豬剖殺或死亡后12 h以內(nèi)進(jìn)行病原分離，可提高副豬嗜血桿菌的分離率。

細(xì)菌培養(yǎng)通過直接利用磷酸化NAD提供V因子，解決了配制培養(yǎng)基的問題。所分離細(xì)菌菌落較大，呈圓形灰白而突起，為革蘭氏染色陰性，短桿狀或球桿狀，細(xì)菌形態(tài)與報(bào)道的相一致，疑似菌株生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不溶血，可發(fā)酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖，但不發(fā)酵甘露醇和木糖，硫化氫試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性，觸酶試驗(yàn)陽性，硝酸鹽試驗(yàn)陽性，均符合副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)特性。

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出，分離菌對氟喹諾酮類藥物和頭孢噻呋鈉高度或中度敏感，有試驗(yàn)報(bào)道認(rèn)為副豬嗜血桿菌對頭孢唑啉高度敏感，對頭孢哌酮、氟苯尼考敏感，而對復(fù)方新諾明、青霉素G等有耐藥性。原因可能是由于氟喹諾酮味苦而對豬群不常采用；左旋氧氟沙星和頭孢噻呋鈉的平均抑菌圈直徑分別為22.0 mm和13.3 mm，說明左旋氧氟沙星在被調(diào)查豬場應(yīng)用較少，保持高度敏感，頭孢噻呋鈉已有應(yīng)用，抗菌作用不理想；氨基糖苷類抗生素在臨床上大量應(yīng)用，通常以注射給藥為主，所以呈現(xiàn)部分為中度敏感；普遍應(yīng)用的青霉素、氨芐西林、阿莫西林和林可霉素等已不敏感。如果豬場經(jīng)常使用某種抗生素，對母豬進(jìn)行定期群體預(yù)防性混飼給藥，其攜帶耐藥基因的細(xì)菌會(huì)通過哺乳、與子代共同生活等而傳遞給下一代，使耐藥性變得嚴(yán)重。也有學(xué)者進(jìn)行中藥藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明金銀花及其復(fù)方制劑對副豬嗜血桿菌抑制作用明顯。因此在臨床上，應(yīng)避免盲目用藥現(xiàn)象，特別是在進(jìn)行群體治療時(shí)，最好先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，針對性地選擇高敏藥物，在發(fā)病早期采用全群注射給藥法，或者采用部分中藥制劑進(jìn)行輔助治療，以便達(dá)到最佳治療效果。

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在寄生菌，是很難控制與凈化的一種呼吸道感染病原。在環(huán)境衛(wèi)生不好的豬場或者有其他發(fā)病感染時(shí)通常容易誘發(fā)副豬嗜血桿菌病的暴發(fā)。要想控制住疫情的暴發(fā)，豬場應(yīng)該積極采取各種綜合防控措施：首先應(yīng)該改善飼養(yǎng)管理，補(bǔ)充飼料的各種營養(yǎng)成分，同時(shí)加強(qiáng)其他疾病的防控，自身也應(yīng)該做好疫苗注射，增強(qiáng)仔豬對副豬嗜血桿菌的免疫力；其次，制訂一套嚴(yán)格的管理制度，對外來的人員或外地購進(jìn)的仔豬應(yīng)該進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫后才可進(jìn)入養(yǎng)殖場；第三，對于養(yǎng)殖場自身環(huán)境進(jìn)行改良，注意殺菌滅菌，防止豬的感染。

總之，副豬嗜血桿菌病的防治，應(yīng)采取“養(yǎng)防結(jié)合”，有實(shí)力的養(yǎng)殖場應(yīng)做藥敏試驗(yàn)，選擇敏感藥物以便快速經(jīng)濟(jì)地控制副豬嗜血桿菌病的發(fā)生。預(yù)防中加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，以減少或消除其他呼吸道病原，如提前斷奶，減少豬群流動(dòng)，杜絕豬生產(chǎn)各階段的混養(yǎng)狀況等。

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