集約化豬場不同階段仔豬豬瘟抗體水平檢測與分析

江春春 ，張任娜 ，賈亞偉 ，韓少鵬 ，王苗苗 ，朱建國 *

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240；2.圣克魯斯生物技術(shù)(上海）有限公司；3.江蘇天兆實(shí)業(yè)有限公司，江蘇 灌南 223500)

豬瘟又稱古典豬瘟(CSF)，是由黃病毒科、瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，而豬是該病毒的唯一自然宿主［1］，由于造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，世界各國特別是養(yǎng)豬大國極為重視，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入必須上報(bào)的傳染病之一。

近年來，許多養(yǎng)豬場反映豬瘟免疫狀況不理想。決定免疫成敗的原因是多方面的，而免疫程序是其中最重要的因素之一［2］。尤其是對(duì)于早期階段的仔豬，母源抗體水平是制定免疫程序首要的考慮因素［3］。就國內(nèi)養(yǎng)豬場來講，豬瘟首免時(shí)間參差不齊，早晚不一。造成這種局面的原因主要是對(duì)于母源抗體消長時(shí)間認(rèn)識(shí)不一致。鑒于此，我們用ELISA方法對(duì)某集約化豬場不同免疫階段的仔豬豬瘟抗體進(jìn)行了檢測分析，之后同樣檢測分析了首免后及二免后的仔豬的豬瘟病毒抗體水平與免疫力狀況，旨在為不同規(guī)模豬場制定科學(xué)、有效的豬瘟免疫程序提供借鑒。

1 材料

1.1 血清樣本

某集約化豬場送檢的一免前（4周齡），以及調(diào)整免疫程序一免后（6周齡）和二免后（10周齡）的仔豬血清。

1.2 檢測試劑盒

IDEXX 豬瘟病毒抗體檢測試劑盒，購于上海賽嘉生物科技有限公司。

2 檢測方法及內(nèi)容

2.1 豬瘟病毒抗體的檢測方法及步驟

采用ELISA方法，用IDEXX豬瘟病毒抗體檢測試劑盒，按照其說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)果判定：若被檢樣本的阻斷率≥40%，該樣本就可以被判為陽性；若被檢樣本的阻斷率≤30%，該樣本就可以被判為陰性。

1）在使用時(shí)，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到室溫18～25 ℃。使用前應(yīng)將各組分放置于室溫條件下至少1 h。

2）分別將50μL 樣品稀釋液加入每個(gè)檢測孔和對(duì)照孔中。

3）分別將50μL的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照加入相應(yīng)的對(duì)照孔中，注意不同對(duì)照的吸頭要更換，以防污染。

4）分別將50μL的被檢樣品加入剩下的檢測孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防污染。

5）輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振蕩，將反應(yīng)板中的溶液混勻。

6）將微量反應(yīng)板用封條封閉或于恒溫濕箱中（18～25 ℃）孵育2 h，也可以將微量反應(yīng)板用封條封閉或于恒溫濕箱中孵育過夜。

7）吸出反應(yīng)孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3 次，注意每次洗滌時(shí)都要將洗滌液加滿反應(yīng)孔，棄去反應(yīng)孔中的洗滌液并拍干反應(yīng)板。也可以用洗板機(jī)洗滌3 次，每個(gè)反應(yīng)孔應(yīng)加300μL左右的洗滌液。注意洗板時(shí)要小心，以免樣本之間的交叉污染。

8）分別將100μL辣根過氧化物酶(HRPO)的抗豬瘟病毒的酶標(biāo)抗體（即取即用）加入反應(yīng)孔中，用封條封閉反應(yīng)板并于室溫下或恒溫濕箱中孵育30 min。

9）重復(fù)步驟7。

10）每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μL的底物溶液，并于避光、室溫條件下放置10 min。加完第1孔后即可計(jì)時(shí)。

11)在反應(yīng)孔中加入100μL的終止液終止反應(yīng)。注意要按加酶標(biāo)二抗的順序加終止液。

12)在450 nm 處測定樣本以及對(duì)照的吸光度值，也可用雙波長（450 nm 和650 nm）測定樣本以及對(duì)照的吸光度值，空氣調(diào)零。

13)計(jì)算樣本和對(duì)照的平均吸光度值。

表 1 4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗體(母源)水平檢測結(jié)果

表 2 一免后（6周齡）和二免后（10周齡）仔豬豬瘟抗體水平檢測結(jié)果

表3 對(duì)4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗原水平檢測

表4 對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬的豬瘟抗原水平檢測

2.2 檢測內(nèi)容

1)對(duì)4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗體(母源)水平檢測。

2)對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬豬瘟抗體水平檢測。

3）調(diào)整免疫程序（豬瘟首免由6周齡提前至4周齡）后豬瘟一免和二免后仔豬豬瘟抗體水平檢測。

3 結(jié)果分析

3.1 4周齡(一免前)仔豬豬瘟抗體(母源)水平檢測

由表1看出，4周齡（首免前）仔豬豬瘟（母源）抗體水平偏低，平均為38.75%。

3.2 調(diào)整免疫程序后仔豬豬瘟抗體水平檢測

由表2 可看出，豬瘟首免由6周齡提前至4周齡后，其一免和二免的仔豬豬瘟抗體水平有明顯的提高，平均值分別為55.3%和62.65%。

3.3 仔豬豬瘟抗原水平檢測

1）由表3 可看出，對(duì)4周齡(一免前)的仔豬進(jìn)行豬瘟抗原水平檢測，有2個(gè)批次出現(xiàn)了豬瘟抗原陽性（2014年2月的13.33%和2014年3月的3%），而2013年12月出現(xiàn)了數(shù)量較多的可疑樣品（7/30）。

2）由表4看出，調(diào)整免疫程序后對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬的豬瘟抗原水平檢測結(jié)果全部為陰性。

4 討論

豬瘟母源抗體是指仔豬通過攝入分娩母豬初乳而獲得的具有對(duì)豬瘟先天性保護(hù)的特異性免疫球蛋白。隨著仔豬日齡的增長，母源抗體滴度緩慢下降，同時(shí)對(duì)豬瘟的先天性保護(hù)也隨之降低[4]。而母源抗體持續(xù)時(shí)間和滴度直接決定了豬瘟首免時(shí)間，首次免疫過早，疫苗會(huì)被血清中尚處在較高水平的母源抗體抵消，難以發(fā)揮免疫作用，而首免過晚，無疑會(huì)使仔豬免疫出現(xiàn)低谷期甚至空檔期，處在感染野毒的高風(fēng)險(xiǎn)期。

通過對(duì)集約化養(yǎng)豬場4周齡（首免前）仔豬豬瘟病毒抗體水平檢測發(fā)現(xiàn)（表1），4周齡（首免前）仔豬豬瘟（母源）抗體水平偏低，平均為38.75%，這意味著此時(shí)仔豬群母源抗體對(duì)仔豬的保護(hù)力比較弱，如果不及時(shí)進(jìn)行免疫，往往很容易發(fā)生豬瘟病毒的早期感染。在對(duì)4周齡仔豬血清進(jìn)行豬瘟抗體檢測的同時(shí)也檢測了豬瘟抗原（表3），結(jié)果是有2個(gè)批次出現(xiàn)了豬瘟抗原陽性（2014年2月的13.33%和2014年3月的3%），而2013年12月出現(xiàn)了數(shù)量較多的可疑樣品（7/30），而調(diào)整免疫程序后對(duì)豬瘟一免和二免后仔豬豬瘟抗原水平檢測結(jié)果全部為陰性（表4）。這從一定程度上也說明此時(shí)仔豬群容易感染豬瘟野毒。鑒于此，該場及時(shí)調(diào)整免疫程序，將豬瘟首免由6周齡提前至4周齡，分別對(duì)豬瘟一免后（6周齡）和二免后（10周齡）的仔豬進(jìn)行豬瘟病毒抗體檢測，其一免和二免的仔豬豬瘟抗體水平有明顯的提高，平均值分別為55.3%和62.65%。這意味著將首免提至4周齡后，6周齡的抗體水平肯定比調(diào)整前提高了；也說明該場調(diào)整豬瘟免疫程序，將首免時(shí)間由6周齡提前至4周齡對(duì)于改善仔豬豬瘟免疫狀況有一定作用。

養(yǎng)豬業(yè)一直是我國畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。但大多數(shù)養(yǎng)殖戶還缺乏根據(jù)豬場定期的抗體水平監(jiān)測結(jié)果確定科學(xué)免疫程序的意識(shí)，主要依靠自身經(jīng)驗(yàn)，或照搬他人程序，免疫程序混亂(如增加免疫密度、劑量、盲目超前免疫等)，致使豬瘟仍沒有得到有效控制。豬瘟的免疫程序有多種，最合理的免疫程序應(yīng)是每個(gè)豬場要根據(jù)自己豬場的實(shí)際情況(主要是豬瘟抗體水平變化規(guī)律)，并根據(jù)血清抗體監(jiān)測結(jié)果及時(shí)調(diào)整制定符合本場實(shí)際的免疫程序。

[1］ 王火平．仔豬豬瘟超前免疫的研究[J].福建畜牧獸醫(yī)，2005，27(4): 8-9.

[2] 苗得園．Herdchek豬瘟抗體ELISA試劑盒在豬瘟控制中的應(yīng)用[J]．中國獸醫(yī)雜志，2006，42(11)：50-51．

[3] KLnig M，Leng sfeld T，Pau iy T，et a1．Classical swine fever virus：mdependent induction of protective immunity by two structural glycoproteins[J]．J Virol，1995，69(10)：6479-6486．

[4] Terpstra C．The immunity against challenge with swine fever virus of piglets from sows vaccinated with C-strajnvaccine[J]． Tijdschrift Voor Diergeneeskunde(Amsterdam),1977,102:1293-1298.