酸漿宿萼中酸漿苦素抑菌穩(wěn)定性的研究

王英臣

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，釀造技術(shù)吉林省高等學(xué)校工程研究中心，吉林 吉林 132101）

酸漿（Physalis alkekengiL.var.franchetii）別名紅姑娘、燈籠草、掛金燈、錦燈籠等，為茄科酸漿屬多年生草本，廣泛分布于內(nèi)蒙和東北等地區(qū)[1]。我國最早的醫(yī)藥著作《神農(nóng)本草經(jīng)》就已經(jīng)將酸漿收錄在內(nèi)，《中華人民共和國藥典》也有收錄。 其藥用部位為干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼，性味苦、寒，歸肺經(jīng)。具清熱解毒、利咽、化痰、利尿之功效[2]。果實(shí)和果萼二者都具有藥食兩用價(jià)值。果實(shí)還可以制造罐頭、果酒、果汁等，在加工果實(shí)過程中，通常剔除果籽，因此產(chǎn)生大量副產(chǎn)物果籽而沒有被有效利用。果籽淡黃色呈腎臟形，扁平，長約1.5～2.0 mm，每個(gè)果實(shí)中含果籽210～320粒，不規(guī)則的散布在果實(shí)。有關(guān)果實(shí)和宿萼方面的研究有一些報(bào)道[3-6]。

研究表明酸漿的煎劑對宋氏桿菌有抑制作用[7]，對淋球菌中度敏感[8]；酸漿中提取的油狀液在試管內(nèi)對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用[7]；從酸漿中提取的針狀晶母液對金黃色葡萄球菌有抑制作用[8]；酸漿的氯仿提取物具有抗分枝桿菌的作用，實(shí)驗(yàn)表明，它們對結(jié)核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌等5種分枝桿菌均有抑制作用[9]。

酸漿主要的生理功能物質(zhì)是酸漿苦素，酸漿苦素類化合物是酸漿屬植物的甾體類成分，也是酸漿屬植物的主要藥用成分。它們的基本結(jié)構(gòu)是被修飾過的麥角甾烷星骨架，該類物質(zhì)被鑒定為16,24-環(huán)-13,14-斷甾體化合物[10-13]。其結(jié)構(gòu)分為酸漿苦素Ⅰ和酸漿苦素Ⅱ，已經(jīng)明確其分子結(jié)構(gòu)和生理功能[14-19]。因?yàn)槠涠嘌踅Y(jié)構(gòu)的存在，在睡茄交脂甾體化合物中，酸漿苦素類化合物屬于在生源氧化水平上最高級的一組。藥理實(shí)驗(yàn)表明，酸漿苦素類化合物具有體外抗腫瘤細(xì)胞的活性和體內(nèi)抗腫瘤的活性，以及抗菌、強(qiáng)心等生物活性[20-22]。

根據(jù)酸漿苦素如此顯著的消炎抗菌作用，本實(shí)驗(yàn)研究其在抑菌方面的作用及其在使用過程中的穩(wěn)定性問題，以期為酸漿苦素在食品防腐中應(yīng)用研究增加新內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿采購于吉林市左家鎮(zhèn)山區(qū)。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bascillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、青霉（Penicilliumsp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、純黃絲衣霉（Byssochlamys fulva）、灰綠曲霉（Aspergullus glaucus）、匍匐曲霉（Fungi imper ficti）、白地霉（Geotrichum candidumLink）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、羅氏酵母（Saccharomyces rosei）和漢氏德巴利氏酵母（Debaryomyces），以上菌種均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2；霉菌瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯（切碎成塊）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL；酵母菌瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母膏10 g、瓊脂5～20 g、水1 000 mL[18]。

1.2 方法

1.2.1 酸漿苦素提取[19]

酸漿植株地上部分經(jīng)干燥得83.56 g，加3倍氯仿在室溫下浸提。氯仿粗提物用硅膠柱進(jìn)行分離。采用乙烷-乙酸乙酯從體積比85∶15至3∶7比例洗脫，得到Al-29（428 mg）進(jìn)一步用氯仿-甲醇以體積比98∶2至8∶2梯度洗脫，最后用甲醇全部洗脫下來，得到Al-29-12（173 mg）部分。

1.2.2 抗菌效力的測定[23-25]

將提取的酸漿苦素溶于二甲基亞砜，制成50 mg/mL酸漿苦素溶液。將6 mm的圓形濾紙片滅菌后放入配制好的酸漿苦素溶液中浸泡10 min、晾干。配制細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌）、霉菌（青霉、黑曲霉、純黃絲衣霉、灰綠曲霉、匍匐曲霉、灰綠曲霉、白地霉）、酵母菌（釀酒酵母、羅氏酵母、漢氏德巴利氏酵母）固體培養(yǎng)基。在無菌條件下，用移液槍準(zhǔn)確取0.5 mL、1×106CFU/mL菌懸液均勻涂布于平板上，將3片浸泡過的圓形濾紙片，間隔貼在含菌平板上，然后將各平皿分別置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，測定抑菌圈直徑，取平均值。以二甲基亞砜作為陰性對照，以6%苯甲酸鈉作為陽性對照，以無菌水為空白對照檢測酸漿苦素的抑菌性。

1.2.3 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

將活化后的菌種用無菌生理鹽水稀釋，配制成106CFU/mL的菌液。用無菌水把酸漿苦素提取物連續(xù)稀釋，使其質(zhì)量濃度為4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6 μg/mL，再將配制好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌冷卻至40～50 ℃后，與稀釋液按體積比10∶1的比例混合，待其凝固，吸取40 μL菌懸液涂布于培養(yǎng)基表面，生化培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h。觀察沒有菌落生長的培養(yǎng)皿為酸漿苦素提取物的MIC，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，并以無菌水、二甲基亞砜、6%苯甲酸鈉為對照。

1.2.4 酸漿苦素抑菌穩(wěn)定特性研究

將純化的供試菌在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線，再挑取菌落接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基內(nèi)，適宜溫度下培養(yǎng)，使菌數(shù)達(dá)105～107CFU/mL，作為供試菌液[21]。

在試管中加入相同體積液體營養(yǎng)培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后在超凈工作臺上無菌操作接入0.1 mL供試菌液，再加入處理后的酸漿苦素液1 mL，搖勻后37 ℃培養(yǎng)12 h。利用紫外-可見分光光度計(jì)，在600 nm波長處測定其吸光度A1，分別測定3次，并取其平均值。對照組加未經(jīng)處理的酸漿苦素液，同樣條件下培養(yǎng)測定吸光度A0，并取其平均值[22]。

式中：A1為在600 nm波長處測定的各個(gè)吸光度；A0為對照組吸光度。

菌懸液吸光度與抗菌率成反比，即菌懸液吸光度越小，對應(yīng)酶解液抗菌率越大，抗菌效果越好。

1.2.4.1 pH值對酸漿苦味素抑菌穩(wěn)定性的影響

取酸漿苦味素0.5 mg，置于10 mL具塞試管中，分別加入pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、12的水溶液（0.1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值）5 mL，溶解，搖勻。置室溫放置12 h，每隔2 h取樣，用適當(dāng)溶液補(bǔ)足取樣量，分別取樣按1.2.4節(jié)方法測定吸光度。

1.2.4.2 溫度對酸槳苦味素抑菌穩(wěn)定性的影響

取酸漿苦味素3份，各0.5 mg，置10 mL具塞試管中，分別加入pH 7.0的水溶液各5 mL，溶解，搖勻。分別置不同溫度水浴中（25～95 ℃）加熱12 h，每隔2 h取樣，置冰浴中，用pH 7.0的水溶液補(bǔ)足取樣量，分別取樣按1.2.4節(jié)方法測定吸光度。

1.2.4.3 光照對酸槳苦味素抑菌穩(wěn)定性的影響

取酸漿苦味素2份，各0.5 mg，置10 mL量瓶中，用pH 7.0的30%甲醇-水溶液適量溶解，并稀釋至刻度，搖勻，稱質(zhì)量。置紫外光下照射12 h，每隔2 h取樣，稱質(zhì)量，分別用適當(dāng)水溶液補(bǔ)足減失重量；另一份密封置自然光下照射10 d（每天照射10 h），每天取樣，用適當(dāng)溶液補(bǔ)足取樣量，分別取樣，按1.2.4節(jié)方法測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸漿苦素的抑菌穩(wěn)定性

表1 酸漿苦素對常見菌的抑制作用（n=3）Table 1 Inhibitory effects of physalins from Calyx seu Fructus Physaliiss against common spoilage and pathogenic microbes (n=3)

當(dāng)添加酸漿苦素抑菌圈直徑與二甲基亞砜陰性對照樣抑菌圈直徑差值大于3 mm時(shí)，認(rèn)定具有抑菌效果。由表1可知，對比陽性和陰性對照樣，可以判斷出酸漿苦素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、青霉、黑曲霉、純黃絲衣霉、灰綠曲霉、匍匐曲霉均有一定的抑制作用，其中對于革蘭氏陽性菌的抑菌效果較明顯，對部分霉菌有抑制效果，對酵母菌無抑菌效果。

2.2 酸漿苦素MIC的確定

表2 酸漿苦素的MICTable 2 MIC values of physalins from Calyx seu Fructus Physaliss

由表2 可知，酸漿苦素對細(xì)菌中革蘭氏陽性菌的抑制效果較好，其次是霉菌。對于金黃色葡萄球菌的MIC為31.3 μg/mL，對于霉菌中純黃絲衣霉的MIC為62.5 μg/mL；對于酵母菌無抑制效果。

2.3 酸 漿苦素的抑菌穩(wěn)定性

2.3.1 溫度對酸漿苦素抑菌效力穩(wěn)定性的影響

圖1 溫度對酸漿苦素抑菌效力穩(wěn)定性的影響Fig.1 Influence of temperature of the antimicrobial activity of physalins from Calyx seu Fructus Physalis

由圖1可知，酸漿苦素在20～35 ℃時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，當(dāng)逐漸升高溫度至95 ℃時(shí)，酸漿苦素的抑菌活力有一定程度的下降，但是下降幅度不大，因此判斷，酸漿苦素最適抑菌溫度為20～35 ℃；40～95 ℃期間，酸漿苦素穩(wěn)定性較好，對微生物抑制效果顯著。

2.3.2 pH值對酸漿苦素抑菌 效力穩(wěn)定性的影響

圖2 pH值對酸漿苦素抑菌效力穩(wěn)定性的影響Fig.2 Influence of pH on the antimicrobial activity of physalins from Calyx seu Fructus Physalis

由圖2可知，錦燈籠藥材中的酸漿苦素在酸性、中性、弱堿性溶液中均具有較好的抑菌性。而在pH 12的溶液中，酸漿苦素抑菌性大幅度降低，說明強(qiáng)堿性環(huán)境會迅速破壞酸漿苦素。應(yīng)該保存在酸性或中性環(huán)境中。

2.3.3 紫外線對酸漿苦素穩(wěn)定性影響

表3 紫外線照射對酸漿苦素抑菌效力的影響Table 3 Influence of visible and UV illumination on the antimicrobial activity of physalins from Calyx seu Fructus Physalis

由表3可知，可見光和紫外線對酸漿苦素抑菌效果影響不明顯。

3 結(jié) 論

酸漿苦素對8種菌均有一定的抑制作用，其中對于細(xì)菌中的革蘭氏陽性菌的抑菌效果較明顯，對部分霉菌有抑制效果，對酵母菌無抑菌效果；同時(shí)，MIC值實(shí)驗(yàn)表明，對于金黃色葡萄球菌的MIC為31.3 μg/mL，對于霉菌中純黃絲衣霉的MIC為62.5 μg/mL；對于酵母菌無抑制效果。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明pH值對酸漿苦素抑菌效力有一定影響，其在20～35 ℃時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，逐漸升高溫度至95 ℃，酸漿苦素的抑菌活力有一定程度的下降，但是下降幅度不大，因此判斷，酸漿苦素最適抑菌溫度為20～35 ℃；40～95 ℃期間，酸漿苦素穩(wěn)定性較好，對微生物抑制效果顯著。酸漿苦素在酸性、中性、弱堿性溶液中均較為穩(wěn)定。而在pH 12的溶液中，酸漿苦素抑菌性大幅度降低，說明強(qiáng)堿性環(huán)境會迅速破壞酸漿苦素。應(yīng)該保存在酸性或中性環(huán)境中。可見光和紫外線對其抑菌效果影響不明顯。

[1]唐庭棣.大興安嶺藥用資源[M].哈爾濱: 哈爾濱出版社, 2001: 121.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2000: 296.

[3]周小平, 楊曉虹, 李立賢.酸漿果實(shí)與宿萼無機(jī)元素的比較分析[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 27(4): 363-364.

[4]李靜, 李娟, 李德坤.錦燈籠化學(xué)成分的研究(Ⅰ) [J].中草藥, 2002,33(8): 692-694.

[5]王和平, 徐美術(shù), 孫亮, 等.錦燈籠降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息, 2004, 21(1): 53-54.

[6]韓陽花.酸漿有效成分的初步研究[D].烏魯木齊: 新疆大學(xué), 2005

[7]李德坤.錦燈籠化學(xué)成分的研究[D].吉林: 吉林大學(xué), 2001.

[8]袁昌衡, 周啟貴, 楊飛中.80種中藥水煎液對淋球菌的抑制試驗(yàn)[J].國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 1997, 17(11): 508-509.

[9]PIETRO R C, KASHIMA S, SATO D N, et al.in vitroantimycobacterial activities ofPhysalisangulataL.[J].Phytomedicine,2000, 7(4): 335-338.

[10]QIU Li, ZHAO Feng, JIANG Zhihu, et al.Steroids and flavonoids fromPhysalis alkekengivar.franchetiiand their inhibitory effects on nitric oxide production[J].Journal of Natural Products, 2008, 71(4):642-646.

[11]CHOI J Y, LEE S J, PARK S, et al.Analysis and tentative structure elucidation of new anthocyanins in fruit peel ofVitis coignetiae pulliat(meoru) using LC-MS/MS: contribution to the overall antioxidant activity[J].Journal of Separation Science, 2010, 33(9): 1192-1197.

[12]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 337-338.

[13]DONG Xue, LIU Yuqiang, CAI Qian.RP-HPLC determination of physalin P inPhysalis alkekengiL.var.franchetii(Msst.) Makino[J].Chinese Traditional Patent Medicine, 2009, 31 (1): 1304-1306.

[14]LONG Qifu, LI Xiangyang, BAI Yun.Fingerprinting analysis of extracts ofPhysalis alkekengiL.var.franchetii(Msst.) Makino[J].Chinese Traditional Patent Medicine, 2010, 32 (1): 179-181.

[15]KANG H, KWON S R, CHOI H Y.Inhibitory effect ofPhysalis alkekengiL.var.franchetiiextract and its chloroform fraction on LPS or LPS/IFN-γ-stimulated inflammatory response in peritoneal macrophages[J].Journal of Ethnopharmacology, 2011, 135(1): 95-101.

[16]ZHENG Yunliang, CHEN Yong, REN Yiping, et al.Quantitative and transformation products analysis of major active physalins fromPhysalis alkekengivar.franchetii(Chinese lantern) using ultraperformance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry and time-of-flight mass spectrometry[J].Phytochemical Analysis, 2012, 23(10): 337-344.

[17]ZHENG Yunliang, CHEN Yong, REN Yiping, et al.An ultra-pressure liquid chromatography with tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of three physalins in rat plasma and its application to pharmacokinetic study ofPhysalis alkekengivar.franchetii(Chinese lantern) in rats[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2012, 9 (12): 94-101.

[18]SOARES M B, BELLINTANI M C, RIBEIRO I M, et al.Inhibition of macrophage activation and lipopolysaccaride-induced death by secosteroids purified fromPhysalis angulataL.[J].European Journal of Pharmacology, 2003, 459: 107-112.

[19]GARY A S.Rainforest endophytes and bioactive products[J].Critical Reviews in Biotechnology, 2002, 22(4): 315-333.

[20]CHOI J Y, LEE S J, LEE S J, et al.Analysis and tentative structure elucidation of new anthocyanins in fruit peel ofVitis coignetiae pulliat(meoru) using LC-MS/MS: contribution to the overall antioxidant activity[J].Journal of Separation Science, 2010, 33(9): 1192-1197.

[21]SHI Peiying, HE Qing, SONG Yue, et al.Characterization and identification of isomeric flavonoidO-diglycosides from genus citrus in negative electrospray ionization by ion trap mass spectrometry and time-of-flight mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta, 2007,598(1): 110-118.

[22]JIN Yu, LIANG Tu, FU Qing, et al.Fingerprint analysis ofLigusticumchuanxiong using hydrophilic interaction chromatography and reversed-phase liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A, 2009, 1216 (11): 2136-2141.

[23]文才藝, 吳元華, 田秀玲.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問題[J].生態(tài)學(xué)志, 2004, 23(2): 86-91.

[24]鄒文欣, 譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào), 2001, 43(9):881-892.

[25]王欽德, 楊堅(jiān).食品試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析基礎(chǔ)[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2009: 428-435.