藏綿羊KAP3.2基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達的研究

楊珂?zhèn)? 胡亮, 羅斌, 劉霜, 鄭玉才, 字向東

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

藏綿羊KAP3.2基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達的研究

楊珂?zhèn)? 胡亮, 羅斌, 劉霜, 鄭玉才, 字向東

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

為研究藏綿羊角蛋白相關(guān)蛋白(KAP3.2)基因結(jié)構(gòu)與功能, 揭示該基因的組織特異性表達規(guī)律.以藏綿羊為研究對象, 分別提取藏綿羊心、肝、脾、腎及皮膚組織中總RNA, 并以此為模板, 通過RT-PCR技術(shù)對藏綿羊KAP3.2基因的cDNA進行克隆、序列分析; 利用Real-time PCR技術(shù)進行組織表達研究.結(jié)果表明: 藏綿羊KAP3.2基因編碼區(qū)全長297bp, 編碼98個氨基酸; 藏綿羊與普通綿羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠、人的相應(yīng)核苷酸同源性分別為99%、97%、96%、79%、75%、73%; 藏綿羊KAP3.2基因在皮膚中高表達, 而在其它組織中相對表達量較低, 說明該基因的表達具有組織特異性.

藏綿羊; KAP3.2基因; 克隆; 序列分析; Real-time PCR

角蛋白作為羊毛纖維的主要成分, 是維持皮膚毛囊結(jié)構(gòu)和形成毛囊細胞的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì), 并且是毛囊中表達最豐富的蛋白質(zhì), 它決定了羊毛的結(jié)構(gòu)特性, 同時在毛囊基因表達和毛發(fā)的生物學(xué)研究中, 其編碼基因也是重要的候選基因[1-3].羊毛纖維具有高度的組織結(jié)構(gòu), 角蛋白的含量達 99%, 平均分子量是 60000[4].羊毛角蛋白共由18 種氨基酸殘基構(gòu)成, 其中半胱氨酸占12%[5].角蛋白家族包括了30種蛋白質(zhì)分子, 是由多基因家族編碼的, 有兩種蛋白: 軟角蛋白和硬角蛋白[6].組成毛纖維的主要是硬角蛋白中間微絲蛋白(keratin intermediate proteins, IF)和微絲角蛋白相關(guān)蛋白(keratin associated proteins, KAP)[7-8].角蛋白相關(guān)蛋白基因(KAP3.2)是高硫角蛋白相關(guān)蛋白基因家族中的一員, 而高硫角蛋白相關(guān)蛋白基因家族在綿羊毛各性狀中可能起到重要作用[9-10].

藏綿羊主要分布于我國的青藏高原地區(qū)以及與之毗鄰的川、甘、滇等高寒地區(qū).正是由于復(fù)雜的地域環(huán)境,藏綿羊具有豐富多樣的生態(tài)類型.目前, Mclaren[11]等通過連鎖分析對綿羊的KAP家族基因進行了染色體定位,找到了決定羊毛纖維細度的位點, 并認為羊毛性狀是受多基因影響的.劉桂芬[12]等研究結(jié)果表明在角蛋白相關(guān)蛋白的多基因家族中的高硫蛋白相關(guān)蛋白中, 位點W08667與羊毛細度的相關(guān)性顯著(P<0.05), 外顯子位點W06933的兩種基因型(AA和BB)與羊毛細度之間的相關(guān)性顯著(P<0.05).有研究把KAP3.2基因作為影響藏綿羊毛長和產(chǎn)毛量性狀的分子標(biāo)記, 以揭示KAP3.2基因與羊毛的光澤度、密度、彈性和強度等性狀是否具有相關(guān)性.因此, 本研究以藏綿羊的皮膚組織為材料, 運用同源序列克隆技術(shù)結(jié)合RT-PCR, 對藏綿羊KAP3.2基因的cDNA進行克隆, 并對其進行生物信息學(xué)分析; 利用Real-time PCR技術(shù), 研究KAP3.2基因在藏綿羊心、肝、脾、腎和皮膚等組織中表達, 旨在了解藏綿羊KAP3.2基因的結(jié)構(gòu)與功能.

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選取健康藏綿羊6只,屠宰后采取心、肝、脾、腎和皮膚組織樣, 迅速放入液氮中帶回實驗室, -80℃保存?zhèn)溆?

1.2 主要試劑

動物組織總RNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000、2×Taq PCR MasterMix 酶購自天根生物科技(上海)有限公司; 克隆載體pMD-19 Vector、氨芐青霉素、X-Gal和IPTG購自大連寶 TaKaRa 生物工程有限公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas(MBI)公司; DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司.

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已公布的綿羊KAP3.2基因序列(AY483216), 利用軟件Primer Premier5 設(shè)計引物PF：5′-ATGGCTTGCTGTGCTCCCCG-3′; PR：5′-AGCAGCACATCACTGAACCC-3′, 擴增片段長363bp.根據(jù)上海Invitrogen公司測序得到的藏綿羊KAP3.2基因序列, 設(shè)計熒光定量引物PF：5′- ACCACCATCTGCTCCTCTGA-3′; PR： 5′-GTTGGCACATAGGTGTCAGG- 3′, 引物由上海Invitrogen公司合成.

1.4 藏綿羊KAP3.2基因cDNA克隆

按照天根動物組織總RNA提取試劑盒說明書分別提取心、肝、脾、腎及皮膚組織總 RNA.

取1uL總RNA, 采用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成.以合成的cDNA第一鏈為模板進行KAP3.2基因擴增, 引物序列為PF：5′-ATGGCTTGCTGTGCTCCCCG-3′; PR：5′-AGCAGCACATCACTGAACCC-3′.25uL反應(yīng)體系: 上、下游引物(20pmol／L)各1μL, 2×Taq PCR MasterMix 12.5uL, cDNA模板0.5μL和ddH2O 10μL.PCR反應(yīng)的條件為: 預(yù)變性95℃、3min; 變性94℃、30s, 退火60℃、40s, 延伸72℃、90s, 35個循環(huán); 延伸72℃、5min;最后4℃保存.

1.5 基因測序

首先以Axygen DNA凝膠回收說明書進行膠回收, 得到的產(chǎn)物于16℃連接過夜, 連接體系10μL： pMD19-T Vector 0.5μL、膠回收產(chǎn)物5μL、Solution I 4.5μL.然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中, 并接種于含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上, 37℃培養(yǎng)過夜.挑取單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)12h, 取菌液作PCR鑒定, 經(jīng)凝膠電泳檢測后, 挑選單克隆菌液送由上海Invitrogen公司測序.

1.6 實時熒光定量PCR檢測

用提取的藏綿羊6個組織的總RNA, 運用Real-time PCR方法檢測不同組織mRNA以及內(nèi)參GAPDH基因的表達量.設(shè)計內(nèi)參GAPDH基因引物PF：5′-TGCCAAGTATGATGAGAT-3′;PR：5′-GAAGGTAGAAGAGTAGT-3′,反應(yīng)體系為10uL: 上下游引物各0.8uL、模板dDNA 0.5uL、SYBR Green Supermix 5Ul、ddH2O 3uL.反應(yīng)條件為: 預(yù)變性95℃、3min; 變性95℃、10s, 退火51.2℃、20s, 延伸65℃、5s, 40個循環(huán); 延伸65℃、5min;4℃保存.實驗結(jié)果用SPSS Statistics V17.0及Excel Viewer 2003 1.0進行統(tǒng)計分析, 用Pfaffi法[13]分析KAP3.2基因在藏綿羊不同組織中的相對表達量, 具體公式為: RE = (1+E ref)Ctref/ (1+E target)Cttarget.其中: E ref和E target分別表示目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率; Ct ref表示對照樣本中目的基因的CT值減去實驗樣本中目的基因CT值, Ct target表示對照樣本中內(nèi)參基因的CT值減去實驗樣本中內(nèi)參基因的CT值.

1.7 生物信息學(xué)分析

利用生物分析軟件DNAMAN將測得的藏綿羊KAP3.2基因序列與GenBank中檢索到的綿羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠和人的相應(yīng)區(qū)域進行核苷酸、氨基酸序列多重比對, 并使用Mega 4.0軟件構(gòu)建物種間系統(tǒng)進化樹.利用生物在線分析軟件預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果與分析

2.1 藏綿羊KAP3.2基因的PCR擴增

以藏綿羊心、肝、脾、腎及皮膚組織總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)為模板, 用特異性引物進行PCR擴增, PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, PCR產(chǎn)物條帶大小為363bp, 與目的片段相近, 結(jié)果如圖1.

2.2 藏綿羊KAP3.2基因序列測定

利用DNAMAN軟件拼接測序結(jié)果得到長為363bp的片段, 與預(yù)期相符, 所得片段為藏綿羊KAP3.2 cDNA序列(KM102758).序列分析結(jié)果表明該編碼區(qū)共297bp, 編碼98個氨基酸, 相對分子質(zhì)量為10411.0, 理論pI值為5.98; 堿基組成A( 16.5%)、C( 38.0%)、G( 21.2%)和T(24.2%).其中嘧啶堿基占62.3%, 嘌呤堿基占37.7%, GC含量為59.2%.

2.3 藏綿羊KAP3.2基因cDNA序列、氨基酸序列同源性比對

用DNAMAN生物軟件, 將藏綿羊KAP3.2基因編碼區(qū)核苷酸序列與GenBank中普通綿羊(AY483216.1)、山羊(AY510120.1)、藏羚羊(XM-005964804.1)、草原鼠(XM-005368238.1)、小鼠(NM-025720.3)和人(NM-031959.2)6個物種相應(yīng)基因序列進行比對.結(jié)果表明, 藏綿羊與普通綿羊親緣關(guān)系最為接近, 只在第42bp處有一個堿基差異(C-T轉(zhuǎn)換), 同源性99%; 其次為山羊和藏羚羊, 分別有8處、12處核苷酸差異, 同源性大小分別為97%、96%;而與草原鼠、家鼠和人同源性相對較小分別為: 79%、75%、73%(圖2).利用BioEdit生物軟件對藏綿羊及普通綿羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠、人各物種KAP3.2基因編碼區(qū)序列進行氨基酸序列推導(dǎo),計算得出藏綿羊與普通綿羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠、人KAP3.2氨基酸序列間同源性分別為: 99%、94%、93%、72%、73%和71%, 具有一定的保守性.

圖1 kap3.2基因電泳檢測結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of kap3.2 gene

圖2 藏綿羊與其他哺乳動物KAP3.2基因核苷酸序列比對Fig.2 Nucleotide sequence alignment of kap3.2 gene in Tibetan sheep and other mammals

采用鄰接法(NJ)對藏綿羊及普通綿羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠和人的核苷酸序列分別構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進化樹(圖3), 由圖可以看出藏綿羊和綿羊親緣關(guān)系最近, 并和山羊、藏羚羊聚為一類, 而草原鼠、家鼠和人聚為另一類, 符合動物分類學(xué)的結(jié)果.

圖3 KAP3.2基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of kap3.2 gene in mammals

2.4 藏綿羊KAP3.2基因在組織中的表達

采用RT-PCR檢測藏綿羊KAP3.2基因在心、肝、脾、腎及皮膚組織中的相對表達量, 分析結(jié)果如圖4, 從圖中可以看出, 該基因在皮膚組織中的相對表達量最高, 在其他組織中也有所表達, 但表達量相對較低.

圖4 藏綿羊KAP3.2基因在不同組織中的表達水平Fig.4 Expression levels of KAP3.2 gene in different tissues of Tibetan sheep

3 討論

本研究通過RT-PCR等方法成功克隆出藏綿羊KAP3.2基因CDS區(qū)序列, ORF Fingder預(yù)測發(fā)現(xiàn)KAP3.2基因編碼區(qū)的長度為297bp, 定位于11號染色體, 無內(nèi)含子, 共編碼98個氨基酸.蛋白質(zhì)分析結(jié)果表明, 該蛋白半衰期為30h, 不穩(wěn)定指數(shù)46.69; 脂肪系數(shù)為64.59, 總平均疏水性為0.167, 屬于疏水性蛋白; 該蛋白無α螺旋結(jié)構(gòu), 有折疊和環(huán)狀結(jié)構(gòu), 分別占靶蛋白的4.08%、95.92%.另外應(yīng)用藏綿羊KAP3.2與其他動物氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析, 從聚類反應(yīng)圖可以看出, 其聚類反應(yīng)結(jié)果與核苷酸同源性比對的結(jié)果一致, 符合動物分類學(xué)的結(jié)果.

Henry[14]、Cockett[15]和Ponz[16]等人通過研究KAP基因和羊毛性狀的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)了控制羊毛纖維直徑、羊毛纖維直徑變異系數(shù)和羊毛長的QTL.王志有[17]和張亞妮[18]等認為KAP基因與絨山羊和細毛羊部分羊毛性狀有一定的相關(guān)性.本研究通過KAP3.2基因與其他哺乳動物相應(yīng)核苷酸序列分析表明, 該基因在核苷酸水平上有差異,而且在相應(yīng)的蛋白水平亦有一定差異.這可能是不同物種在不同環(huán)境下進化的結(jié)果, 要確定這種結(jié)果, 需要再做進一步的研究.

KAP3.2基因與羊毛產(chǎn)量和羊毛長性狀之間存在一定的關(guān)系, 研究中可作為藏綿羊產(chǎn)毛量和毛長性狀的分子標(biāo)記.本研究熒光定量結(jié)果顯示, 該基因在皮膚組織中的高表達與預(yù)測結(jié)果一致, 而在其他組織中也有所表達,但表達量相對較低.說明該基因主要在皮膚組織中發(fā)揮重要作用, 這也與其生物學(xué)功能相符合.

4 結(jié)論

本試驗采用實時RT-PCR技術(shù), 以藏綿羊皮膚組織為材料克隆KAP3.2基因的CDS區(qū)序列(GenBank NO: KM102758).通過Real-time PCR檢測KAP3.2基因在所測組織中均有表達, 但在皮膚組織中高表達, 說明該基因與羊毛性狀具有重要作用.

[1]王志有, 陳玉林, 徐秋良, 等.藏系綿羊 KAP3.2 基因多態(tài)性及其對部分經(jīng)濟性狀的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2011, 42(2): 284-288.

[2]許漢峰.角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因(KAP和KRT)與綿羊毛品質(zhì)的相關(guān)性研究[D].石河子大學(xué), 2008.

[3]姚毅, 雷承志, 君亮, 等.新疆細毛羊和陜北細毛羊羊毛細度候選基因的PCR-SSCP分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報, 2006, 34(12): 6-10.

[4]趙宗勝.綿羊產(chǎn)毛性能的細胞及分子生物學(xué)調(diào)控機理研究[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[5]管峰,石國慶,劉守仁.角蛋白家族及其對羊毛生長發(fā)育的調(diào)控[J].生命的化學(xué), 2007, 27(1): 92-93.

[6]SHIBUYA K, KUDON J, OBAYASHI A, et al.Comparative genomics of the keratin- associated protein (K AP) gene clusters in human, chimpanzee, and baboon [J].Mamm Genome, 2004, 15(3): 179-192.

[7]PARRY DA, SMITH TA, ROGERS MA, et al.Human hair keratin- associated proteins: Sequence regularities and structural implications [J] .J Struct Biol, 2006, 155(2): 361-369.

[8]KARIYA N, SHIMOMURA Y, ITO M.Size polymorphisms in the human ultrahigh sulfur hair keratin-associated protein 4, KA P4, gene family [J].J Investig Dermatol, 2005, 124(6): 1111-1118.

[9]YAHAQI S, SHIBUYA K, OBAYASHI I, et al.Identification of two novel clusters of ultrahigh-sulfur keratin-associated protein genes on human chromosome11 [J].Biochem Biophys Res Commun, 2004, 318(3): 655- 664.

[10]尹俊, 扈庭茂, 李金泉,等.與綿羊KAP6-1相似的6個絨山羊全長cDNA的克隆與序列分析[J].遺傳學(xué)報, 2004, 31(5): 502-507.

[11]MCLAREN RJ, ROGERS GR, DAVIES KP, et al.Linkage mapping of wool keratin and keratin-associated protein genes in sheep [J].Mamm Genome, 1997, 8( 12) : 938-940.

[12]劉桂芬, 田可川, 張恩平, 等.優(yōu)質(zhì)細毛羊羊毛細度的候選基因分析[J].遺傳, 2007, 29(1): 70-74..

[13]PFAFFL MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR [J].Nucleic Acids Res, 2001, 29(9):e45.

[14]HENRY HM, DODDSS KG, WULIJI T, et al.A genome screen for QTL for wool traits in a Merinox Romney backcross flock [J].Mamm Genome, 1998, 8: 938-940.

[15]COCKETT NE, SHAY TL, SMIT M.Analysis of the sheep genome [J] .Physiol Genomics, 2001, 7(2): 69-78.

[16]PONZ R, MORENO C, ALLAIN D, et al.Assessment of genetic variation explained by markers for wool traits in sheep via asegment mapping approach[J].Mamm Genome, 2001, 12(7): 569-572.

[17]王志有, 祁全青, 陳玉林.高原型藏綿羊KAP基因多態(tài)性與部分產(chǎn)毛性狀的關(guān)系研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報, 2010, 26(14): 18-22.

[18]張亞妮, 張恩平, 吳迪, 等.內(nèi)蒙古絨山羊KAP基因與經(jīng)濟性狀關(guān)系的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2007, 38(5): 447-451.

Cloning and tissue expression of KAP3.2 gene in Tibetan sheep

YANG Ke-wei, HU Liang, LUO Bin, LIU Shuang, ZHENG Yu-cai, ZI Xiang-dong
(School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

This study was carried out to obtain and analyze sequence of Tibetan sheep KAP3.2 gene by RT-PCR, and to determine its mRNA expression in different tissues by real-time PCR. Total RNA was extracted from the heart, liver, spleen, kidney and skin tissues of the Tibetan sheep. The results showed that the coding region of Tibetan sheep KAP3.2 gene was 297bp in length, encoding 98 amino acids. The homologies of nucleotide sequences of the coding region of KAP3.2 gene between Tibetan sheep and sheep, goat, chiru, prairie vole, mouse and human were 99%, 97%, 96%, 79%, 75% and 73%, respectively. The KAP3.2 gene was highly expressed in the skin tissue and relatively was low in other tissues studied. The expression level of KAP3.2 mRNA is tissue specific.

Tibetan sheep; KAP3.2 gene; cloning; sequence analysis; real-time PCR

S826

A

1003-4271(2014)06-0809-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.06.02

2014-09-25

字向東(1963-）, 男, 白族, 云南云龍人, 教授, 研究方向: 動物遺傳育種與繁殖; E-mail: zixd@sina.com.

國家863計劃課題(2013AA102506); 西南民族大學(xué)優(yōu)秀學(xué)生培養(yǎng)工程項目(2014ZYXS58)