大理地區(qū)鴿糞中新型隱球菌的分離與鑒定

陶星辰，劉曉英，尚秋菊，楊 靜，蘇鴻雁*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

大理地區(qū)鴿糞中新型隱球菌的分離與鑒定

陶星辰1，劉曉英1，尚秋菊2，楊 靜2，蘇鴻雁2*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

目的：對(duì)大理地區(qū)鴿糞中新型隱球菌的帶菌率進(jìn)行調(diào)查，為有效避免由鴿糞中隱球菌的感染提供參考依據(jù)。方法：采用黑米培養(yǎng)基對(duì)140份鴿糞中新型隱球菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果：共分離獲得46株新型隱球菌，尿素試驗(yàn)均為陽(yáng)性。結(jié)論：大理地區(qū)鴿糞中新型隱球菌陽(yáng)性率較高，為32.9%。

新型隱球菌；黑米培養(yǎng)基；鴿糞

新型隱球菌于1894年被確認(rèn)為一種人類條件致病性病原微生物〔1〕，且廣泛分布于自然界，可以從土壤、蝙蝠洞、腐爛的蔬菜、水果、昆蟲(chóng)以及健康人體體表、口腔、腸道以及鴿糞等多種基質(zhì)中分離得到，在所有基質(zhì)中鴿糞中新型隱球菌的陽(yáng)性率和生物量都是最高的〔2〕。新型隱球菌病的感染途徑多是由呼吸道侵入人體，由肺經(jīng)血行播散時(shí)可侵犯所有臟器組織，主要侵犯呼吸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可侵犯骨、關(guān)節(jié)和皮膚〔3-4〕。近年來(lái)，新型隱球菌病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，尤其在AIDS患者中，感染率高達(dá)30%〔5〕。為準(zhǔn)確評(píng)估隱球菌病與鴿糞之間的關(guān)系，有效避免由鴿糞污染而引起隱球菌感染的潛在危險(xiǎn)，及時(shí)有效地預(yù)防和控制隱球菌病的發(fā)生與傳播，對(duì)鴿糞中新型隱球菌的帶菌率情況進(jìn)行了調(diào)查。

1 材料和方法

1.1樣本來(lái)源云南省永平縣、大理下關(guān)鎮(zhèn)、南澗縣、彌渡縣養(yǎng)鴿戶鴿棚中的鴿糞。

1.2培養(yǎng)基的制備

1.2.1 黑米培養(yǎng)基的制備 稱取70 g黑米，加蒸餾水1 000 mL煮沸約30 min，用四層紗布過(guò)濾，再向?yàn)V液中加入20 g瓊脂粉，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，混勻，自然pH，分裝于500 mL錐形瓶?jī)?nèi)，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至50℃后加入0.25 g阿莫西林。

1.2.2 YEPD培養(yǎng)基的制備 稱取10 g酵母浸膏粉，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，加蒸餾水1 000 mL，pH值6.0，分裝于100 mL錐形瓶?jī)?nèi)，121℃高壓滅菌15 min。

1.2.3 尿素瓊脂培養(yǎng)基的制備 稱取10 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、1.0 g蛋白胨、5 g NaCl、2 g KH2PO4、0.012 g酚紅，加蒸餾水定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至50℃后加入20%的尿素溶液50 mL，混合均勻后分裝試管制斜面，凝固后置4℃冰箱備用。

1.3主要試劑5 mol∕L醋酸鉀（乙酸鉀98 g，加雙蒸水140 mL，加熱溶解，用冰乙酸調(diào)至pH 5.0，再加雙蒸水定容至200 mL，高壓滅菌20 min），3%SDS法抽提緩沖液（100 mM Tris-HCI pH 7.5，10 mM Na2EDTA pH 8.0，10 mM DTT 3%SDS），1×TE緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0）和2×EsayTaq PCR SuperMix（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.4采集樣本采集方法：用無(wú)菌竹簽從鴿舍隨機(jī)采取鴿糞標(biāo)本，放入無(wú)菌封口袋帶回實(shí)驗(yàn)室放入4℃冰箱保存，一周內(nèi)進(jìn)行新型隱球菌分離培養(yǎng)。采集時(shí)間：2014年3月12日至3月15日。采集量：永平縣39份，大理下關(guān)鎮(zhèn)31份，南澗縣40份，彌渡縣30份，總計(jì)采集140份鴿糞標(biāo)本。

1.5標(biāo)本處理方法每個(gè)樣品稱取0.6 g鴿糞置于含有10 mL無(wú)菌生理鹽水的滅菌試管中，充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置30 min，用移液槍取100 μL上清液，接種于黑米培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3 d。

1.6標(biāo)本分離培養(yǎng)及形態(tài)鑒定新型隱球菌接種在黑米培養(yǎng)基后可形成酵母型菌落，初期呈白色，3 d后轉(zhuǎn)棕黃色，濕潤(rùn)黏稠，狀似膠汁。用接種環(huán)挑取典型新型隱球菌菌落，通過(guò)墨汁染色，顯微鏡下觀察呈圓形或卵圓形，菌體外有寬厚莢膜的菌株初步鑒定為新型隱球菌，并對(duì)其進(jìn)行劃線純化。

腎上腺為腹膜后位器官，毗鄰器官較多，左腎上腺根據(jù)其前方在不同的斷面毗鄰器官，分別為胃底、胰體、降結(jié)腸、脾及其動(dòng)靜脈等。毗鄰腎上腺的結(jié)構(gòu)發(fā)生病變形成類似囊實(shí)性腫物時(shí)，在影像學(xué)容易表現(xiàn)為左腎上腺來(lái)源的腫物。故CT讀片時(shí)未引起注意而易誤診為腎上腺腫瘤或囊腫[4-5]。

1.7尿素酶試驗(yàn)進(jìn)行形態(tài)初檢后，將分離純化的待檢菌株接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天觀察培養(yǎng)基顏色變化，持續(xù)觀察7 d。由于新型隱球菌可以產(chǎn)生尿素酶，所以如果培養(yǎng)基顏色變?yōu)樘壹t色或者粉色為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.8分子生物學(xué)鑒定

1.8.1 基因組DNA的提取 刮取一接種環(huán)純化后的新型隱球菌接種到錐形瓶中的YEPD液體培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中，置搖床200 r∕min振蕩培養(yǎng)16～18 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用移液槍取l mL YEPD培養(yǎng)液的菌體置于2.0 mL Eppendorf管中，12 000 r∕min離心2 min收集菌體；用無(wú)菌水洗滌2次后12 000 r∕min離心2 min，棄上清；在沉淀中加入150 μL 3%SDS抽提緩沖液充分混勻；55℃水浴30 min，期間輕輕來(lái)回顛倒數(shù)次；加入1×TE緩沖液450 μL顛倒混勻；加入2∕5體積冰冷的5 mol∕L醋酸鉀，冰浴10 min后 12 000 r∕min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的Eppendorf管中（同法重復(fù)離心1次）；加入等體積的異丙醇，輕輕來(lái)回顛倒數(shù)次混勻，－20℃放置10 min；12 000 r∕min離心10 min，棄上清；沉淀以70%的冷乙醇洗滌3次，風(fēng)干后加入適量的雙蒸水溶解DNA沉淀，放置備-20℃?zhèn)溆谩?〕。

1.8.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL，模板DNA 1 μL，CN5（GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G）和CN4（ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T）各1 μL，2×EsayTaq PCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，72℃10 min，35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1分離結(jié)果從140份鴿糞標(biāo)本中，培養(yǎng)分離鑒定出46株新型隱球菌，總陽(yáng)性率達(dá)32.9%（陽(yáng)性率=新型隱球菌出現(xiàn)的樣本數(shù)∕總的樣本數(shù)×100%，即46∕140×100%=32.9%）。見(jiàn)表1。其中永平縣的39份鴿糞標(biāo)本中分離出14株新型隱球菌，陽(yáng)性率35.9%，大理市下關(guān)鎮(zhèn)的31份鴿糞標(biāo)本中有9株陽(yáng)性，陽(yáng)性率29.0%，南澗縣40份鴿糞標(biāo)本中有15株陽(yáng)性，陽(yáng)性率37.5%，彌渡縣30份鴿糞中有8株陽(yáng)性，陽(yáng)性率26.7%。

表1 大理地區(qū)鴿糞中新型隱球菌調(diào)查結(jié)果

2.2尿素酶試驗(yàn)結(jié)果所有待測(cè)菌株在尿素培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后培養(yǎng)管上部出現(xiàn)了粉紅色，直至7 d后培養(yǎng)基均呈桃紅色。

2.3 PCR檢測(cè)引物CN4和CN5被用來(lái)快速鑒定新型隱球菌，新型隱球菌PCR擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度約為136 bp〔6-7〕。待測(cè)菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的條帶產(chǎn)物。見(jiàn)圖1。長(zhǎng)度均約為136 bp，以此可以判斷此次分離獲得的目的菌株均是新型隱球菌，與培養(yǎng)基分離鑒定和顯微形態(tài)鏡檢結(jié)果一致。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳部分結(jié)果

3 討論

本次采集了云南省大理州4個(gè)縣市的的干燥鴿糞140份，陽(yáng)性率達(dá)32.9%，與2010年Zarrin M〔8〕等在伊朗阿瓦士地區(qū)鴿群中新型隱球菌陽(yáng)性率34%的調(diào)查結(jié)果相近；高于李莉〔5〕等在上海地區(qū)調(diào)查鴿糞中新型隱球菌22.2%的陽(yáng)性率和吳媛〔9〕等在北京昌平區(qū)調(diào)查鴿糞中新型隱球菌4.87%的陽(yáng)性率。

Swinne-Desgain〔2〕等研究發(fā)現(xiàn)新鮮鴿糞中高濃度的氨會(huì)抑制新型隱球菌的生長(zhǎng)，干燥鴿糞為新型隱球菌提供了一個(gè)天然的優(yōu)良生長(zhǎng)環(huán)境，在此環(huán)境中，新型隱球菌可以分解高濃度的尿素、兒茶酚胺和其它含氮化合物，為其生長(zhǎng)提供能量〔10〕。相比之下，暴露于空氣中的干燥鴿糞中會(huì)比較容易分離到新型隱球菌，此次采集的鴿糞標(biāo)本為干燥鴿糞，這可能是與其他調(diào)查者結(jié)果出現(xiàn)差異的原因之一。另外此次研究采用黑米培養(yǎng)基進(jìn)行新型隱球菌的分離，由于黑米中除含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、植物脂肪、纖維素、維生素、微量元素等，還含有豐富的生物活性物質(zhì)如黃酮類、花青素、生物堿、胡蘿卜素等物質(zhì)〔11〕，這些物質(zhì)是新型隱球菌新陳代謝及生長(zhǎng)繁殖所必需的原料和能量。新型隱球菌在黑米培養(yǎng)基上形成的菌落較大，濕潤(rùn)，狀似膠汁，呈棕黃色，極大的方便了對(duì)新型隱球菌的分離，因此，此次分離及檢出率較高。

此次研究中4個(gè)采樣地新型隱球菌的出現(xiàn)頻率有一定的差異，這可能與采集方法、樣本量、氣候及地理距離等有關(guān)，確切原因還有待進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

〔1〕鄒先彪.新生隱球菌分子生物學(xué)分類方法的研究〔D〕.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2001.

〔2〕KOZEL T R，KWON-CHUNG K J，PERFECT J R，et al. Cryptococcus:from human pathogen to modelyeast〔M〕. Washington，DC:ASM press，2011:1-311.

〔3〕賈祎鵬.STE12α基因?qū)π滦碗[球菌毒力的影響研究〔D〕.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2009.

〔4〕孔慶濤.氧含量對(duì)新型隱球菌形態(tài)學(xué)及毒力因子影響的初步研究〔D〕.南京：南京大學(xué)，2012.

〔5〕李莉，王家春.鴿糞中新型隱球菌的分離和鑒定〔J〕.臨床皮膚科雜志，2000，29（4）:198-200.

〔6〕MITCHELL T G，F(xiàn)REEDMAN E Z，WHITE T J，et al. Unique oligonucleotide primers in PCR for identification of Cryptococcus neoformans〔J〕.Journal of clinical microbiol?ogy，1994，32（1）:253-255.

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*通信作者：蘇鴻雁，教授.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

Isolation and Identification of Cryptococcus neoformans from Pigeon Droppings in Dali

TAO Xingchen1,LIU Xiaoying1,SHANG Qiuju2,YANG Jing2,SU Hongyan2*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Agriculture and Biology Science,Dali University, Dali,Yunnan 671003,China）

Objective:To investigate the positive rate of Cryptococcus neoformans in pigeon droppings in Dali and provide a basis for effectively avoiding its infection.Methods:A black rice culture medium was used for isolation and identification of Cryptococcus neoformans in 140 pigeon droppings.Results:46 strains of Cryptococcus neoformans were isolated and urea tests all proved positive.Conclusion:The positive rate of Cryptococcus neoformans in pigeon droppings in Dali was very high（32.9%）.

Cryptococcus neoformans;black rice culture medium;pigeon droppings

R379.5

A

1672-2345（2014）08-0060-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.020

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31060019、31100093）；云南省教育廳重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目（ZD2010010）；云南省中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才資助項(xiàng)目（2012HB-042）；云南省高校滇西生物多樣性科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目（云教函〔2011〕93號(hào)）；大理學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目（TDⅠ-05）

2014-04-11

2014-05-11

陶星辰，碩士研究生，主要從事微生物與疾病研究.