美洲大蠊提取物對ISO致大鼠心肌缺血的保護(hù)作用

陸 麗，張旭強(qiáng)，甘 平，何 旭，陳俊雅，彭 芳*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

美洲大蠊提取物對ISO致大鼠心肌缺血的保護(hù)作用

陸 麗1，張旭強(qiáng)2，甘 平2，何 旭2，陳俊雅2，彭 芳2*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：研究美洲大蠊提取物（CⅡ-3）對ISO所致大鼠心肌缺血的保護(hù)作用。方法：采用皮下注射ISO誘發(fā)大鼠心肌缺血。觀察心肌缺血大鼠ECG的S-T段、Q-T間期的變化，血清中LDH、SOD、CK和MDA含量及心肌病理損傷情況。結(jié)果：3個(gè)劑量組的CⅡ-3都能降低S-T段的偏移和縮短Q-T間期（P＜0.05），中、高劑量組能顯著降低MDA的含量（P＜0.01）和提高SOD的活性（P＜0.05），高劑量組能降低CK的活性（P＜0.05），但3個(gè)劑量組對LDH活性影響較?。≒＞0.05）。病理檢測顯示3個(gè)劑量組的CⅡ-3能不同程度的減輕大鼠心肌病理組織的損傷程度。結(jié)論：CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血具有一定的保護(hù)作用。

美洲大蠊；心肌缺血；異丙腎上腺素

美洲大蠊（Periplaneta americana）屬昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂、偷油婆等。近年來學(xué)者們對美洲大蠊進(jìn)行了系列的研究，并取得一定的成果。已有學(xué)者研究表明，從美洲大蠊中提取制備的心脈隆注射液具有強(qiáng)心、增加心輸出量及改善微循環(huán)等作用〔1-2〕，提示美洲大蠊中具有較好的心血管活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討美洲大蠊另一個(gè)有效部位CⅡ-3對異丙腎上腺素（Isoprenaline，ISO）誘發(fā)大鼠心肌缺血是否有保護(hù)作用，為開發(fā)美洲大蠊系列藥物提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動物SD大鼠，雌雄各半，體重180～200 g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)提供，合格證號：SCXK（渝）2007003。

1.2儀器1.0型高速低溫離心機(jī)（德國Heraeus）；JH-C-06-04型紫外分光光度計(jì)（上海青華科技儀器有限公司）；HS21-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）；BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.3試劑與藥品超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（批號：20100816）；乳酸脫氫酶（LDH）測試盒（批號：20100720）；肌酸激酶（CK）測試盒（批號：20100723）；丙 二 醛（MDA）測試 盒（批 號：20100819），以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。ISO（上海禾豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號：100203）；復(fù)方丹參片（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠；生產(chǎn)批號：100128）；普萘洛爾（汕頭金石制藥總廠；批號：100302）。CⅡ-3由大理學(xué)院劉光明教授提供。CⅡ-3是從美洲大蠊中經(jīng)特定工藝提取所得，提取物占生藥的比率為0.2%。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動物分組與模型的建立取雌雄各半的SD大鼠，25%烏拉坦腹腔注射麻醉（1 g∕kg），背位固定。記錄給藥前大鼠正常ECG（心電圖），棄去S-T段、T波有異常改變和心律失常的大鼠。將篩選后的70只大鼠，隨機(jī)分為7組，即正常對照組，陰性對照組，陽性對照組（復(fù)方丹參片320 mg∕kg；普萘洛爾20 mg∕kg），CⅡ-3高、中、低劑量組（100 mg∕kg；50 mg∕kg；25 mg∕kg），每組10只。各組動物分別灌胃給藥，1次∕d，連續(xù)7 d，第5天灌胃給藥40 min后，除正常對照組外皮下多點(diǎn)注射ISO（5 mg∕kg）（皮下多點(diǎn)注射部位包括：四肢根部和背部共5～6點(diǎn)，10 s內(nèi)注射完畢），連續(xù)3 d。正常對照組皮下注射等體積的生理鹽水。最后一次注射ISO后，測以下各指標(biāo)。2.2 ECG記錄采用BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)ECG 10 min。與缺血前ECG相比，以QRS復(fù)合波起點(diǎn)的連線作等電線觀察S-T段的偏移，每次取5個(gè)心動周期的S-T段偏移值（△ST）和Q-T間期變化值（△QT），以其均數(shù)作為觀測指標(biāo)。以陰性對照組ST段向上或向下偏移＞0.1 mv為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 CK、LDH、SOD的活性以及MDA含量檢測最后一次注射ISO 6 h后，各組大鼠眼球取血，4℃低溫離心（3 500 r∕min），15 min，取血清，按測試盒說明測定CK、LDH、SOD和MDA的含量。

2.4組織病理檢測取血后處死大鼠，立即取出心臟，用銳利刀片取左室與心尖部中點(diǎn)左心室前壁小塊心?。w積為2 mm×2 mm×2 mm），固定、脫水、包埋、切片、HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌病理組織。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陰性對照組△ST＞0.1 mv，且與正常對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明實(shí)驗(yàn)造模成功。與陰性對照組比較，CⅡ-3的3個(gè)劑量組都能降低S-T段的偏移和縮短Q-T間期（P＜0.05），但無劑量依賴性；與普萘洛爾組比較，CⅡ-3中劑量的作用與普萘洛爾比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與復(fù)方丹參片組比較，CⅡ-3中、高劑量的作用與復(fù)方丹參片比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)心肌缺血大鼠ECG的△QT和△ST的影響（，n=10）

表1 CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)心肌缺血大鼠ECG的△QT和△ST的影響（，n=10）

注：與正常對照組比較#P＜0.05；與陰性對照組比較*P＜0.05；與普萘洛爾組比較△P＜0.05；與復(fù)方丹參片組比較&P＜0.05。

△ST∕mv 0.02±0.01*△&0.42±0.11#△&0.08±0.03*&0.17±0.02#△*0.29±0.04#△&*0.13±0.08#*0.15±0.09#*△組別正常對照組陰性對照組普萘洛爾組復(fù)方丹參片組CⅡ-3低劑量組CⅡ-3中劑量組CⅡ-3高劑量組劑量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0△QT∕ms 1.01±0.52*&12.24±2.89#△&3.80±1.02*4.99±3.54#*9.75±3.97#△&*6.80±2.54#*7.50±3.10#*△

與正常對照組比較，陰性對照組的MDA含量顯著高于正常對照組（P＜0.01）；陰性對照組SOD含量顯著低于正常對照組（P＜0.01）。與模型對照組比較，CⅡ-3中、高劑量組與陽性對照組一樣能顯著降低MDA的含量（P＜0.01）和提高SOD的含量（P＜0.05）。見表2。

表2 CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)心肌缺血大鼠SOD、MDA的影響（，n=10）

表2 CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)心肌缺血大鼠SOD、MDA的影響（，n=10）

注：與陰性對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

SOD∕(U∕mL) 251.88±13.43**192.73±12.83##231.18±28.64*226.61±27.83*#207.38±37.85#220.28±23.05#*221.85±21.88*#組別正常對照組陰性對照組普萘洛爾組復(fù)方丹參片組CⅡ-3低劑量組CⅡ-3中劑量組CⅡ-3高劑量組劑量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0 MDA∕(nmoL∕mL) 4.24±1.92**8.48±1.99##4.57±0.84**4.40±1.05**5.38±1.22*4.92±1.68**5.08±2.06**

陰性對照組的LDH活性、CK活性顯著高于正常對照組（P＜0.01）。與陰性對照組比較，CⅡ-3高劑量與陽性對照組一樣能降低血清中CK的活性（P＜0.05），CⅡ-3的3個(gè)劑量略能降低LDH活性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)心肌缺血大鼠血清中CK、LDH活性的影響（，n=10）

表3 CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)心肌缺血大鼠血清中CK、LDH活性的影響（，n=10）

注：與陰性對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

LDH∕(U∕mL) 2.68±0.74**4.19±0.59##3.39±0.65*#3.19±0.58*#3.62±0.68#3.69±0.75#3.55±0.66#組別正常對照組陰性對照組普萘洛爾組復(fù)方丹參片組CⅡ-3低劑量組CⅡ-3中劑量組CⅡ-3高劑量組劑量∕(mg∕kg)——20.0 320.0 25.0 50.0 100.0 CK∕(U∕mL) 1.12±0.18**1.62±0.31##1.34±0.29*#1.37±0.22*#1.52±0.25#1.41±0.36#1.38±0.35*#

在光學(xué)顯微鏡下觀察，正常對照組大鼠心肌組織未見病理形態(tài)學(xué)改變。陰性對照組可見心肌纖維明顯萎縮、斷裂，心肌間炎癥細(xì)胞浸潤明顯，部分心肌纖維胞漿濃縮呈凝固性壞死，部分呈溶解性壞死；陽性對照組心肌組織損傷較陰性對照組明顯減輕，僅見個(gè)別或極少量炎癥細(xì)胞浸潤和少量心肌纖維萎縮。CⅡ-3低劑量組的心肌組織損傷較陰性對照組有所減輕，但仍可見部分心肌纖維萎縮、斷裂，心肌間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤較明顯；CⅡ-3中、高劑量組心肌組織損傷較陰性對照組明顯減輕，只見少量炎癥細(xì)胞浸潤和少量心肌纖維萎縮和斷裂，間質(zhì)間隙變寬。見圖1。

圖1 心肌缺血大鼠心室病理切片圖（HE，×100）

5 討論

ISO屬于人工合成的兒茶酚胺類β腎上腺素受體激動藥，大劑量的ISO可激活心肌細(xì)胞β1受體，使心臟過度興奮，心肌耗氧量增加；同時(shí)激活β2受體，使冠狀動脈擴(kuò)張，冠脈壓力下降，從而導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞損傷，造成心肌細(xì)胞膜內(nèi)外離子成分及其濃度改變，從而影響心肌細(xì)胞的極化狀態(tài)和除極、復(fù)極程序，反映在ECG上表現(xiàn)為心電圖的改變〔3〕。ISO所誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血損傷模型的缺血損傷的漸進(jìn)性及心肌酶學(xué)變化均類似于人類急性心肌梗死的病變特征，所以此模型是評價(jià)心肌保護(hù)藥常用的心肌缺血損傷模型之一，已有30余年的歷史，該模型簡便、穩(wěn)定，便于觀察急性心肌缺血大鼠的ECG變化〔4〕。

心肌缺血ECG的改變其病理學(xué)基礎(chǔ)是心肌的血液供應(yīng)障礙，由于心肌血液微循環(huán)障礙的程度不同，ECG分別表現(xiàn)為S-T段呈弓背型抬高、T波倒置，病理性Q波。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組比較CⅡ-3（25，50，100 mg∕kg）能降低S-T段的偏移和縮短Q-T間期（P＜0.05），提示CⅡ-3具有防治或減輕心肌損傷，改善缺血缺氧狀態(tài)，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

當(dāng)心肌細(xì)胞缺血受損，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)LDH和CK外漏致血中LDH和CK升高，所以血清中LDH、CK活性可以間接反映心肌損傷程度變化。特別是CK在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發(fā)生時(shí)，血清中CK水平迅速提高。心肌梗死時(shí)，CK在發(fā)病6 h內(nèi)升高，24 h達(dá)高峰，3～4日內(nèi)恢復(fù)正常，因此CK的變化是臨床診斷患者患有心肌缺血性損傷的重要參考指標(biāo)〔5〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CⅡ-3（100 mg∕kg）與普萘洛爾、復(fù)方丹參片一樣能降低血清中CK的活性（P＜0.05），說明一定濃度的CⅡ-3可以穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜，對心肌缺血損傷有一定的保護(hù)作用。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)3個(gè)劑量的CⅡ-3略能降低血清中LDH活性，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是LDH廣泛分布在心肌、骨骼肌和肝臟中，當(dāng)ISO導(dǎo)致大鼠心肌缺血的同時(shí)也損傷了其它組織器官，進(jìn)而使大鼠血清中LDH的活性大大增強(qiáng)，而一定量的CⅡ-3不能完全抵抗LDH的這種活性。

心肌缺血時(shí)心肌病理形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，可見心肌間炎癥細(xì)胞浸潤明顯，心肌纖維胞漿濃縮呈凝固性或溶解性壞死。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CⅡ-3組大鼠的心肌組織損傷較陰性對照組明顯減輕，只見少量炎癥細(xì)胞浸潤和心肌纖維萎縮、斷裂。說明CⅡ-3可以改善心肌病理損傷程度。

心肌缺血時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基是一類具有高度化學(xué)反應(yīng)活性的含氧基團(tuán)，是機(jī)體內(nèi)氧分子的不完全代謝產(chǎn)物。它可聚集在體表、心臟、血管、肝臟和腦細(xì)胞中，它能與各種細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，造成細(xì)胞膜的損傷或細(xì)胞的死亡。如果沉積在血管壁上，會使血管發(fā)生纖維性病變，導(dǎo)致動脈管硬化、高血壓、心肌梗塞等，是造成人類衰老和疾病的元兇。SOD是需氧生物體內(nèi)的一種含金屬離子的酶蛋白，它是機(jī)體清除氧自由基的重要酶類，它的活性的高低間接地反映了機(jī)體清除自由基的能力。當(dāng)心肌受損時(shí)，SOD活性降低，含雙鍵的脂肪酸過氧化生成MDA，MDA可使膜成分之間發(fā)生交聯(lián)和聚合，從而使膜的變構(gòu)、離子傳遞、酶活性等發(fā)生改變〔6-11〕。因此MDA的含量高低可間接反映心肌細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CⅡ-3（50，100 mg∕kg）與普萘洛爾、復(fù)方丹參片一樣能顯著降低血清中MDA的含量和提高血清中SOD的活性，說明CⅡ-3可以提高機(jī)體清除氧自由基的能力，抑制脂質(zhì)過氧化過程，減少脂質(zhì)過氧化物對心肌的損傷。

本實(shí)驗(yàn)表明，CⅡ-3對ISO誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠具有一定的保護(hù)作用，其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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*通信作者：彭芳，教授.

（責(zé)任編輯 李 楊）

Protective Effect of Periplaneta americana Extracts on Myocardial Ischemia Induced by Isoproterenol in Rats

LU Li1,ZHANG Xuqiang2,GAN Ping2,HE Xu2,CHEN Junya2,PENG Fang2*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the protective effect of CⅡ-3 extracted from Periplaneta americana on myocardial ischemia in rats induced by isoproterenol(ISO).Methods:The myocardial ischemia model was made by using subcutaneous injection of ISO in rats. The change of S-T segment and Q-T interval of electrocardiogram(ECG)was observed,and the content of LDH,CK,SOD and MDA in serum was measured.The pathological lesion of myocardium were observed.Results:Three types of dosage of CⅡ-3（low,25 mg∕kg; mid,50 mg∕kg;high,100 mg∕kg）all significantly reduced S-T segment deviation and shortened Q-T interval(P＜0.05).Middle and high dosage of CⅡ-3 significantly reduced the content of MDA(P＜0.01)and raised the activity of SOD(P＜0.05).High dosage of CⅡ-3 reduced the activity of CK(P＜0.05),but three dosage of CⅡ-3 had the subtle effect on the activity of LDH. Pathological examination showed that three dosages of CⅡ-3 could reduce the pathological lesion of myocardium in rats to varying degrees.Conclusion:CⅡ-3 had some protective effect on myocardial ischemia in rats induced by ISO.

Periplaneta americana;myocardial ischemia;isoproterenol

R285.5

A

1672-2345（2014）08-0007-04

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.003

2014-04-04

2014-05-12

陸麗，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事機(jī)能學(xué)教學(xué)研究.