水貂阿留申病分子生物學及防控技術(shù)研究進展

王振軍，吳威，閆喜軍，呼延良浩，紀銀鈴，侯海良，張蕾※，李明霞

(1．中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春130112；2．吉林省集安市種子公司，吉林集安134200；3．安華農(nóng)業(yè)保險股份有限公司吉林省分公司，長春130122；4．吉林省白山市畜牧總站，吉林白山134300)

水貂阿留申病(Aleutian Disease，AD)是由阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus，ADV)引起的，被稱為毛皮動物三大疫病之一。該病可以嚴重影響水貂的毛皮質(zhì)量，損害其生育能力，降低存活率，給養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1]。水貂阿留申病的發(fā)病和預后受到水貂基因型、年齡、毒株種類等多種因素的影響，典型的病理及臨床癥狀主要有以下兩方面：對于新生幼貂來說，由于體內(nèi)抗體水平低且自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，ADV可以引發(fā)新生幼貂的急性間質(zhì)性肺炎，死亡率很高；另一方面，對于成年貂則多是以慢性、持續(xù)性感染為主，以漿細胞增多、高免疫球蛋白血癥、免疫復合物介導的腎小球腎炎和動脈炎為特點，有的病貂還有非化膿性腦膜炎的癥狀[2，3]，臨床上可見病貂漸進性消瘦、口渴、貪飲等癥狀，母貂除上述癥狀外可見產(chǎn)仔量下降、死胎、流產(chǎn)數(shù)量增多[4]；剖檢可見腎臟腫大發(fā)白，脾臟有陳舊的壞死斑等。病貂可通過糞便、唾液長期向外界排毒，養(yǎng)殖場工作人員不規(guī)范的操作也起到了被動傳播ADV的作用，所以AD在國內(nèi)水貂養(yǎng)殖場的流行是十分普遍的。由于ADV的感染呈現(xiàn)抗體依賴性增強(ADE)的現(xiàn)象，至今仍無有效的疫苗研發(fā)思路，國內(nèi)、外學者現(xiàn)多在AD診斷方面開展研究，以期用更加精準的檢測方法淘汰阿留申病貂。

1 水貂阿留申病的分子生物學研究進展

1.1 ADV的基因組結(jié)構(gòu)

國際病毒分類委員會(ICTV)第八次會議將ADV歸類為細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒亞科(Parvovirinae)阿留申病毒屬(Amdovirus)[5]。ADV是單股負鏈DNA病毒，基因組全長約4.8Kb，3′端和5′端均含有200bp左右的末端回文序列并形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3′端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)較短，5′端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)較長，它的主要功能是作為病毒的復制起始點和包裝信號[6]。目前，國內(nèi)、外已經(jīng)分離出多種ADV毒株，如高致病性的ADV-Utah、ADV-K、ADV-United等；低致病性的ADV-Pullman等；以及對水貂無致病力的ADV-G株，它是ADV-Utah株在體外細胞傳代培養(yǎng)后失去致病力的實驗株，只能造成體外培養(yǎng)的Vero、CRFK等細胞感染，而并不引起水貂發(fā)病[7]。到目前為止，在世界范圍內(nèi)還沒有任何官方報道的關(guān)于ADV的基因型，根據(jù)世界各水貂養(yǎng)殖國家的流行病學調(diào)查，各地都有不同的ADV毒株，甚至同一個地區(qū)同一個養(yǎng)殖場都有不同的毒株存在。現(xiàn)今只有ADV-G株病毒完成了全基因組序列的測序工作[6]，本文以ADV-G株病毒序列為例對其進行結(jié)構(gòu)和功能方面的簡要說明。

Alexandersen等[8]早在1988年就對ADV的轉(zhuǎn)錄進行了研究，證實了ADV的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)主要包括5個：左開放閱讀框(LORF)約長1 859nt，右開放閱讀框(RORF)約長2 105nt和3個較短的中間開放閱讀框(mid-ORFs)，此外，還有啟動子序列(TATA box)和polyA位點。整段序列含有2個啟動子P3、P36，由這2個啟動子分別啟動轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過mRNA的可變剪接合成R1、R2、R2′、R3、RX 5種mRNA，最終翻譯成ADV的各種蛋白。

1.2 ADV基因的復制和表達

ADV屬細小病毒科成員，它的復制和轉(zhuǎn)錄是在宿主細胞核內(nèi)進行的，基因組DNA的復制所需要的DNA聚合酶及輔助因子都依賴于宿主細胞，而且要求宿主細胞處于有絲分裂的S期，此時的宿主細胞中DNA聚合酶的活性旺盛。當被感染的細胞進入有絲分裂S期時，ADV便利用細胞核內(nèi)高活性的DNA聚合酶進行自身基因組的合成，以此來完成自身基因組DNA的復制[9]。ADV在復制方式上與其他細小病毒類似，即先以3′端發(fā)夾結(jié)構(gòu)提供的3′-OH為引物，在DNA聚合酶的作用下合成復制型中間體，再由復制型中間體形成子代病毒基因組[10]。在ADV的基因組DNA復制的過程中，ADV的NS1蛋白起到了關(guān)鍵作用，它的作用包括在特異性位點切斷DNA、ATP酶作用和解旋酶作用[11]。

ADV基因表達的蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白包括VP1、VP2 2種，是由位于基因組右側(cè)的ORF負責編碼的。編碼VP1蛋白的基因(2 043nt)包含了編碼VP2蛋白基因(1 917nt)的全部序列，只是在其5′端較編碼VP2蛋白的基因多出126個堿基，對應的在表達的VP1蛋白的N端比VP2蛋白多出了42個氨基酸殘基；非結(jié)構(gòu)蛋白包括NS1、NS2和NS3，是由位于基因組左側(cè)的ORF編碼的，其中NS1是最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，它是經(jīng)過轉(zhuǎn)錄剪接后形成的1 962nt的序列翻譯出的，大小約為72Ku[8，12]。ADV基因的表達調(diào)控主要在基因的復制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯4個環(huán)節(jié)。其中復制和轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)是發(fā)生在宿主細胞核內(nèi)的，主要行使調(diào)控功能的是NS蛋白和ADV基因組自身的調(diào)控單元、末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)、啟動子區(qū)、polyA等，這些調(diào)節(jié)蛋白和調(diào)控基因共同構(gòu)成了ADV基因組表達調(diào)節(jié)系統(tǒng)[13]。Christensen等[14]在用昆蟲桿狀病毒表達體系表達ADV蛋白時，通過免疫熒光試驗證實了ADV的VP1蛋白、VP2蛋白、NS1蛋白在昆蟲細胞的細胞核周圍表達，NS2蛋白在細胞質(zhì)中表達，所以ADV基因在轉(zhuǎn)錄后和翻譯環(huán)節(jié)也可能發(fā)生在對應的區(qū)域。

1.3 ADV蛋白的功能

1.3.1非結(jié)構(gòu)蛋白在ADV的非結(jié)構(gòu)蛋白中，研究最多的是NS1蛋白，它是病毒在侵染宿主細胞和復制時發(fā)揮功能的一種多功能蛋白，尤其在基因組DNA復制和啟動子調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，分子量約為71Ku。Christensen等[14]曾用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達NS1蛋白，獲得了大量有活性的純化蛋白，此外，Christensen等[15]還認為，NS1蛋白存在細胞抑制作用或細胞毒作用，因其發(fā)現(xiàn)NS1蛋白在昆蟲細胞中表達的時候引起了細胞形態(tài)學的變化，在轉(zhuǎn)染期間重組的桿狀病毒滴度下降了10倍。對于ADV-NS2蛋白的研究目前尚缺乏充足的資料，但有學者認為其在ADV基因組復制方面起作用[16]。而ADV-NS3蛋白存在與否還沒有確切的說法，國內(nèi)、外學者對其研究較少。Christensen等[14]曾用實驗證實，NS3蛋白在昆蟲細胞中表達時呈彌散式分布，分子量約為10Ku，但對其功能沒有詳述。

1.3.2結(jié)構(gòu)蛋白ADV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2共同組成了ADV的蛋白衣殼，大小分別約85Ku和75Ku，但是兩者的比例卻相差很大，VP2占約90%，VP1只占約10%[17]。可見ADV-VP2蛋白占了病毒的絕大部分，所以可以推斷VP2蛋白上存在ADV主要抗原表位，對此國內(nèi)、外學者針對VP2蛋白進行了體外表達，并且用多種方法驗證了其抗原性良好。Christensen等[14]用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達2種結(jié)構(gòu)蛋白，并通過免疫熒光證實其在昆蟲細胞的細胞核周圍進行表達，而且在電子顯微鏡下觀察到表達蛋白和ADV-G株病毒的衣殼蛋白很相似，難于區(qū)分；Bloom等[18](1994)用重組的核型多角體病毒表達了ADV的結(jié)構(gòu)蛋白，并通過CIEP方法證實其抗原性比商業(yè)抗原更敏感；Anna Knuuttila等[19](2009)用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達ADV的VP2蛋白并建立了ELISA方法診斷AD，據(jù)報道，該診斷方法的敏感性和特異性分別達到了99%和97%；梁冬瑩[20](2007)采用原核表達系統(tǒng)分段表達ADV結(jié)構(gòu)蛋白基因，經(jīng)過CIEP驗證重組蛋白在診斷試驗中重復性、敏感性和特異性均較好，這些研究均證實ADV的VP2蛋白有很好的反應原性。

2 水貂阿留申病診斷方法的研究進展

自1956年發(fā)現(xiàn)AD以來，各國學者都在尋找一種能夠防治該病的方法，因ADV病毒感染后會呈現(xiàn)抗體依賴性增強的現(xiàn)象[21]，所以很難通過研制有效的疫苗來控制預防該病，因此各國學者在ADV的檢測手段上不斷創(chuàng)新，通過定期對ADV病貂的篩查、淘汰病貂來凈化貂場，進而達到防控該病的目的。ADV的檢測方法有多種，主要有病原學、血清學和分子生物學診斷，以下將分別予以介紹。

2.1 病原學診斷

這種診斷方法有賴于電子顯微鏡技術(shù)。對感染病貂的臟器(肝臟、脾臟、腎臟或淋巴結(jié))進行研磨并超速離心后，用除菌膜過濾上清液，進行負染后在電子顯微鏡下可直接觀察病毒粒子，病毒粒子直徑22nm～25nm，呈正20面體[22]。這種檢測方法周期長，且不容易與其他細小病毒區(qū)分，一般只用于輔助檢測，不適合臨床檢測。

2.2 血清學診斷

血清學診斷是應用最為廣泛的診斷方法，具體的檢測方法主要有以下幾種：碘凝集試驗(IAT)、對流免疫電泳(CIEP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接免疫熒光、免疫復合物(CIC)檢測等。

2.2.1碘凝集試驗Henson等[23]于1962年率先將IAT應用于水貂阿留申病的檢測，IAT的檢測原理是：ADV感染后血液內(nèi)的丙種球蛋白增多，當丙種球蛋白增加到一定濃度后會和碘發(fā)生凝集反應。但是這種檢測方法是非特異性的，所有能夠引起丙種球蛋白增多的疾病都可以發(fā)生碘凝集反應，比如結(jié)核、肝腎等疾病均可呈現(xiàn)IAT陽性反應[24]。而且在ADV感染的初期，血液中的丙種球蛋白并沒有明顯地升高，到感染后的3周～4周才出現(xiàn)較高水平的丙種球蛋白，所以IAT無法檢測ADV感染初期的水貂，也就錯失了從根本上撲滅該病的機會，這樣IAT在ADV的篩查上存在很高的假陰性和假陽性率，因此這種方法被應用多年但始終沒能達到撲滅該病的目的。

2.2.2對流免疫電泳(CIEP) 1972年由Cho等[25]在加拿大應用CIEP診斷水貂阿留申病，這是在世界上首次將這種方法用于檢測水貂阿留申病，我國從20世紀80年代起開始應用CIEP來檢測阿留申病，直到現(xiàn)在這種方法是國內(nèi)、外公認的檢測ADV的黃金法則。CIEP的原理是：抗原抗體在電場的作用下和ADV相向運動，當兩者相遇之后會在瓊脂凝膠板中形成清晰的沉淀線。研究顯示，水貂在感染ADV后9d～11d就可以產(chǎn)生沉淀抗體，并能夠穩(wěn)定地維持6個月以上，這種方法無論在特異性還是敏感性、重復性上都遠遠高于IAT法，很快在世界各水貂養(yǎng)殖國家應用，并一直沿用至今[26]。我國在20世紀80年代由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所研制的水貂阿留申病CIEP抗原獲得批準，并成功商業(yè)化，廣泛應用于海關(guān)以及國內(nèi)水貂養(yǎng)殖單位。目前國外也有用CIEP法并輔助PCR法來共同檢測AD的報道[27]。

2.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗早在1982年，國外學者Wright等[28]嘗試了用ELISA方法檢測ADV，并對這種方法的檢測結(jié)果做出了評價，但由于當時該方法存在很高的假陰性率，所以不是一種有效地檢測AD的方法。吳威等[29]用感染水貂ADV-G株病毒的貓腎細胞CRFK建立了檢測水貂阿留申病病毒抗體的PPA—ELISA方法，這種方法的敏感性較CIEP高，有快速準確的優(yōu)點。隨著對ADV結(jié)構(gòu)蛋白的深入研究和分子生物學技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在國內(nèi)、外已經(jīng)有報道用分子生物學的手段將ADV的VP2基因克隆到表達載體上，然后在特定的表達系統(tǒng)中批量表達VP2蛋白，再用表達的VP2蛋白作為包被抗原，進而建立一種更加快速靈敏地檢測AD的ELISA方法。如Anna Knuuttila等用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達了VP2蛋白；梁冬瑩等用原核表達系統(tǒng)成功地表達了VP2蛋白，而且以上方法表達的蛋白經(jīng)過驗證其敏感性和特異性均較高，但是用這些方法表達出的蛋白未經(jīng)純化，其中含有大量的細胞成分，若對該抗原進行純化，其特異性和敏感性會更高。

2.2.4間接免疫熒光試驗Porter等[30]在1969年用這種方法檢測AD，該法需要利用細胞培養(yǎng)技術(shù)對培養(yǎng)細胞進行同步接毒，在細胞出現(xiàn)病變后，再用待檢血清中和病毒，最后用熒光二抗反應后在熒光顯微鏡下觀察熒光現(xiàn)象。雖然這種方法在診斷方面很特異，但由于這種方法周期長、步驟繁瑣、重復性差等缺點不適合應用于臨床診斷。

2.2.5循環(huán)免疫復合物檢測(CIC) ADV感染水貂后在體內(nèi)形成抗原抗體復合物，由于AD主要是由免疫復合物引起的疾病，所以檢測水貂體內(nèi)CIC含量也可以作為一種診斷依據(jù)。1997年，趙元楷等[31]建立了應用聚乙二醇(PEG)沉淀比濁法檢測阿留申病貂血清中CIC的新方法并獲得應用。也有學者建議在貂場選種時，同時應用CIEP法和CIC檢測法，挑選免疫復合物OD值低的留作種用[23]。

2.3 分子生物學診斷

2.3.1聚合酶鏈式反應(PCR) 自20世紀80年代PCR技術(shù)發(fā)明以來，在分子生物學領(lǐng)域得到普遍應用，它利用高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個步驟循環(huán)往復，可以使待擴增的DNA片段在數(shù)小時內(nèi)復制上百萬倍，從而實現(xiàn)了基因的體外擴增。PCR技術(shù)被廣泛應用在疾病檢測方面。根據(jù)GenBank上公布的ADV序列，用引物設(shè)計軟件設(shè)計出針對ADV的特異性引物，用這種特異性引物進行PCR檢測，可以十分敏感、特異地檢測出待檢物中是否有ADV，其準確性和特異性要高于CIEP。國外早已有關(guān)于用PCR方法檢測水貂阿留申病的報道，但國內(nèi)目前對AD的檢測還是依賴于CIEP。Jensen等[32]研究證實了PCR檢測ADV的敏感性要高于CIEP。2012年在丹麥舉行的國際科學大會毛皮動物產(chǎn)業(yè)分會上，有關(guān)于用PCR方法防控ADV的報道，A.Cepica等[27]指出，從20世紀70年代中期加拿大等國就開始用CIEP法防控水貂阿留申病，經(jīng)過近40年的努力，水貂阿留申病得到了有效地控制，但還是有小范圍的流行，因為病毒在感染水貂開始時隱藏在感染水貂體內(nèi)，這時很難用血清學手段檢測出來，這樣就造成漏檢，漏檢的假陰性水貂在過了病毒的潛伏期后就會表現(xiàn)出癥狀。隱藏在環(huán)境中的病毒，隨時可能潛伏到動物體內(nèi)并對動物造成感染，所以他認為用CIEP和PCR 2種方法來共同監(jiān)測AD是更為有效的方法。

此外，國外還有用核酸雜交技術(shù)對貂群進行阿留申病的普檢的報告，如Haas L等[33]就用Southern blot方法分析了從感染水貂的脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、骨髓等臟器中提取的DNA樣品，結(jié)果顯示只在脾臟和骨髓中檢測到了病毒DNA的復制。目前國外在這方面研究較多，國內(nèi)沒有這方面研究的報道。

綜上所述，CIEP法仍是目前應用最多、最廣泛的檢測AD的方法，這種方法要求的檢測設(shè)備相對簡單，便于操作，易于推廣，而且檢測成本較低。隨著對ADV-VP2蛋白的研究的深入和分子生物學技術(shù)的發(fā)展，各國學者探索了多種針對VP2蛋白的體外表達的方法并開始應用表達抗原研究新的AD診斷方法，比如ELISA、膠體金等，這些檢測方法將是未來AD診斷防控的新趨勢。但在新的檢測手段尚未成熟之前，CIEP還是檢測AD的主要方法。

3 阿留申病的防制

國外在AD的控制和撲滅措施上做法比較徹底，比如在丹麥，法律規(guī)定每個農(nóng)場每年都要上交AD檢測報告，用于引種的水貂必須在引種前檢測AD陰性，而一個貂場經(jīng)CIEP檢測有3個以上的水貂呈血清學陽性或即使僅在1只水貂體內(nèi)檢測到了ADV，這個農(nóng)場則被視為ADV感染的農(nóng)場[34]，而對被認定為ADV感染農(nóng)場的水貂則要全群撲殺。但國內(nèi)由于特殊的養(yǎng)殖模式，AD在貂場的流行很普遍，目前還做不到全群撲殺，只能通過篩查逐步淘汰ADV陽性貂。AD現(xiàn)在沒有特異性的預防和治療方法，因此防制該病主要依賴針對傳染病的綜合防制措施。

3.1 最重要的在于飼養(yǎng)管理

給予水貂新鮮、優(yōu)質(zhì)、全價的飼料，以提高機體免疫力，降低發(fā)病率。

3.2 嚴格遵守養(yǎng)殖場獸醫(yī)衛(wèi)生制度

對籠舍等用具定期進行火焰消毒，糞便及時清理并作無害化處理，地面、籠舍要堅持用消毒液消毒，這是防止該病傳播和流行的有效辦法。

3.3 建立定期檢疫淘汰制度

建議貂場在每年的打皮期和配種期前進行CIEP的篩查，淘汰陽性貂，這樣可以將貂場的感染貂控制在較低的范圍內(nèi)。

3.4 建立完善的引種檢疫工作

對引進種貂要進行嚴格的檢疫，不但要求CIEP檢測陰性，有條件的要進行PCR檢測，這樣可以保證引進種貂無ADV感染。

3.5 抗病貂新品種的培育

通過雜交育種的辦法培育抗AD的水貂新品種，此法周期較長，但能從根本上阻斷AD。

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