白藜蘆醇對脂多糖誘導的肺泡巨噬細胞微小RNA—146a表達的影響

曾振國 邵強 李勇 丁成志 卿城 劉芬 詹以安 聶成 揭克敏 龔洪翰 錢克儉

【摘要】目的 觀察白藜蘆醇對脂多糖（LPS）誘導肺泡巨噬細胞微小RNA-146a（miR-146a）表達的影響。方法 將體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細胞（NR8383）按2×106個/孔接種于六孔板，細胞貼壁90 min后，分為磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組、終質量濃度LPS（1 μg/mL）處理組、白藜蘆醇（1 μg/mL）預處理30 min+終質量濃度LPS（1 μg/mL）處理組、白藜蘆醇（1 0 μg/mL）預處理30 min+終質量濃度LPS（1 μg/mL）處理組。細胞培養(yǎng)6 h后，收集細胞和細胞培養(yǎng)上清液，采用實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-146a的表達變化，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達變化。結果 與PBS對照組相比，LPS處理組細胞中miR-146a和TNF-α蛋白表達量均明顯升高[miR-146a表達倍數(shù)（5，92±1，57） 倍vs. （1，03±0，58） 倍，P<0，01；TNF-α質量濃度 （644，2±36，82） pg/mL vs. （26，15±13，43 ） pg/mL，P<0，01]。與LPS處理組相比，白藜蘆醇預處理組（1 μg/mL和10 μg/mL）細胞中miR-146a表達量均明顯升高[miR-146a表達倍數(shù)（8，67±1，18） 倍、（11，17±1，40） 倍 vs. （5，92±1，57）倍，P<0，01]，TNF-α蛋白質量濃度均顯著降低[TNF-α質量濃度（447，7±41，48） pg/mL、（345，0±42，54 ）pg/mL vs. （644，2±36，82 ） pg/mL，P<0，01]，且相比于較低質量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導miR-146a的表達、抑制TNF-α蛋白的分泌（P<0，01）。結論 白藜蘆醇可以上調肺泡巨噬細胞內(nèi)miR-146a的表達水平，推測miR-146a參與了白藜蘆醇的抗炎過程。

【關鍵詞】 白藜蘆醇；微小RNA-146a；肺泡巨噬細胞；腫瘤壞死因子-α

Effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide-induced micRoRNA-146a in alveolaR macRophages Zeng Zhenguo，Shao Qiang，Li Yong，Ding Chengzhi， Qing Cheng， Liu Fen， Zhan Yian， Nie Cheng， Jie Kemin， Gong Honghan， Qian Kejian. DepaRtment of CRitical CaRe Medicine， FiRst Affiliated Hospital， Medical College of Nanchang UniveRsity， Nanchang 330006， China

CoRResponding authoR： Qian Kejian，Email：qkj0607@sohu，com

【AbstRact】Objective To obseRve the effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide （LPS） -induced micRoRNA-146a （miR-146a） in alveolaR macRophages. Methods Rat alveolaR macRophages（NR8383）weRe seeded at 2×106cell/poRe in 6 well plates in vitRo and incubated foR 90 min. NR8383 weRe Randomly divided into fouR gRoups： contRol gRoup， NR8383 stimulated with phosphate buffeR solution （PBS）； LPS-stimulated gRoup， NR8383 stimulated with 1μg/mL of LPS； ResveRatRol-tReated gRoup， NR8383 tReated with diffeRent concentRations of ResveRatRol （1 μg/mL oR 10 μg/mL） foR 30 min， then stimulated with 1 μg/mL of LPS. AfteR incubation foR 6 h， the cells weRe haRvested and the supeRnatant of cell cultuRe medium was collected. The expRession of miR-146a of cells was detected by using fluoRoilluminance Real-time quantitative PCR device， and the levels of TNF-α pRotein in the supeRnatant weRe assayed by using enzyme-linked immunosoRbent assay （ELISA）.Results CompaRed with contRol gRoup， the expRession of miR-146a and the level of TNF-α weRe significantly incReased in LPS stimulated gRoup （miR-146a s expRession folds： 5，92±1，57 vs 1，03±0，58，P<0，01；TNF-α：644，2±36，82 pg/mL vs. 26，15±13，43 pg/mL， P<0，01）. CompaRed with LPS-stimulated gRoup， the expRessions of miR-146a weRe significantly incReased in ResveRatRol-tReated gRoups （1 μg/mL and 10 μg/mL） （miR-146a s expRession folds： 8，67±1，18， 11，17±1，40 vs. 5，92±1，57， both P<0，01）， but the level of TNF-α in the supeRnatant was significantly Reduced （TNF-α： 447，7±41，48 pg/mL， 345，0±42，54 pg/mL vs. 644，2±36，82 pg/mL， both P<0，01），CompaRed with the low concentRation of gRoup（1 μg/mL）， the expRession of miR-146a weRe significantly incReased and the pRoduction of TNF-α in the supeRnatant of cells was significantly Reduced in high concentRation of ResveRatRol gRoup （10 μg/mL） （P<0，01）.Conclusions ResveRatRol could up-Regulate the expRession of miR-146a in alveolaR macRophage inflammatoRy Response， suggesting miR-146a involved in the anti-inflammtoRy pRocesses with ResveRatRol tReatment.

【Key woRds】ResveRatRol； MicRoRNA-146a； AlveolaR macRophages； TumoR necRosis factoR-α

大量臨床及實驗研究表明，白藜蘆醇對膿毒癥肺損傷具有保護作用[1-5]。微小RNA-146a（miR-146a）是TLRs/NF-κB炎癥通路中重要的負反饋調控介質，能夠抑制炎癥反應[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a參與了肺泡巨噬細胞炎癥反應，有望成為抑制肺泡巨噬細胞炎癥反應的新途徑[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇與miRNA關系密切，有可能通過miRNA發(fā)揮其抗炎作用[9-11]。然而，在肺泡巨噬細胞炎癥反應模型中，白藜蘆醇是否影響miR-146a的表達以及是否通過上調miR-146a的表達來抑制炎癥介質釋放均未見報道。

1 材料與方法

1，1 實驗材料

大鼠肺泡巨噬細胞株NR8383（中國科學院細胞庫），胎牛血清（美國HyClone），Ham s F-12K培養(yǎng)基（美國Sigma-AldRich），LPS（E，coli 0111∶ B4，美國Sigma-AldRich），白藜蘆醇（美國Enzo life sciences），TRIzol Reagent（美國InvitRogen），四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索來寶科技有限公司），TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應（PCR）檢測試劑盒、TaqMan MicRoRNA 逆轉錄試劑盒、TaqMan MicRoRNA 檢測試劑盒（美國ABI），十二烷基硫酸鈉（SDS，美國Sigma-AldRich），大鼠TNF-α ELISA試劑盒（上海明睿生物），氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1，2 細胞培養(yǎng)

R8383細胞培養(yǎng)于含15%FBS、1，5 g/L碳酸氫鈉、2 mmol L-谷氨酰胺的Ham s F-12K完全培養(yǎng)基中，置于大氣壓下37 ℃、含5%體積分數(shù)CO₂的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液，3～4 d傳代1次。

1，3 MTT比色法檢測白藜蘆醇對細胞活性的影響

取指數(shù)生長期NR8383細胞，按每孔細胞0，5×10⁴個接種至96孔板。細胞貼壁90 min后，分別加入0，1、1、10、50、100 μg/mL終質量濃度的白藜蘆醇，每組設5個復孔，同時設陰性對照組（等體積PBS替代白藜蘆醇）和陽性對照組（等體積10%二甲亞砜替代白藜蘆醇）。加藥后細胞再培養(yǎng)48 h，加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入三聯(lián)溶解液100 μL/孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育8 h，用酶標儀（波長570 nm）測定各孔的吸光度（OD 570 nm）值。

1，4 細胞處理及分組

取指數(shù)生長期NR8383細胞，按每孔細胞2×106個接種至6孔板。細胞培養(yǎng)90 min后，分為以下四組：（1） LPS處理組：培養(yǎng)板中加入LPS溶液（終質量濃度1 μg/mL）；（2） PBS對照組：培養(yǎng)板中加入等體積PBS溶液；（3） 白藜蘆醇+LPS組：培養(yǎng)板中加入不同濃度白藜蘆醇溶液（終質量濃度1 μg/mL、10 μg/mL）預處理30 min后，加入LPS溶液（終質量濃度1 μg/mL）。細胞培養(yǎng)6 h后，離心收集細胞上清液和細胞團塊，保存于-80 ℃冰箱，分別用于ELISA檢測和細胞總RNA提取。

1，5 檢測指標及方法

1，5，1 TNF-α蛋白測定 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，檢測按照ELISA試劑盒使用說明書進行檢測。

1，5，2 miR-146a表達測定 采用TRIzol法提取細胞中的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性及純度，紫外分光光度計測定總RNA濃度。采用TaqMan MicRoRNA逆轉錄試劑盒進行反轉錄，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應（PCR）檢測試劑盒進行PCR擴增，反應條件：95 ℃ 10 Rain；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個擴增循環(huán)，在ABI 7500定量PCR儀上擴增和檢測。操作均按說明書進行，所有操作均在冰上完成。選取U6 snRNA作為內(nèi)參照，miR-146a的相對表達量采用2-△△Ct計算。

1，6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13，0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0，05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2，1 MTT比色法檢測白藜蘆醇對NR8383

細胞活性的影響

白藜蘆醇在0，1～100 μg/mL的質量濃度范圍內(nèi)對NR8383細胞無毒性作用。見圖1。

2，2 TNF-α蛋白含量及細胞內(nèi)miR-146a的表達變化

表1顯示，與PBS對照組相比，LPS處理組TNF-α蛋白含量及miR-146a表達均明顯升高（P<0，01）；與LPS處理組相比，白藜蘆醇預處理組能明顯減少TNF-α蛋白含量，并進一步上調miR-146a表達，且相比于較低質量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導miR-146a的表達、抑制TNF-α蛋白的分泌（P<0，01）。這表明白藜蘆醇能抑制肺泡巨噬細胞TNF-α蛋白表達和上調miR-146a表達。

3 討論

膿毒癥并發(fā)急性肺損傷是膿毒癥高病死率的主要原因[12，13]，如果發(fā)生膿毒癥時避免或減輕肺損傷的發(fā)生，將有助于提高膿毒癥患者的成功救治率。肺組織中最多的非實質性細胞是肺泡巨噬細胞[14]，膿毒癥發(fā)生時，肺泡巨噬細胞內(nèi)TLRs/NF-κB炎癥通路活化，導致大量炎癥基因的轉錄活化，失控性釋放大量炎癥因子，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應，導致ALI的發(fā)生。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要致病成分，是導致TLRs/NF-κB活化的常見因子。本研究結果顯示，LPS刺激肺泡巨噬細胞后，導致TNF-α分泌顯著增加。

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，是天然的植物抗菌素。它能夠抑制肺泡巨噬細胞的活化，減少細胞內(nèi)炎癥因子的釋放，避免或減輕膿毒癥時肺損傷，提高膿毒癥時肺損傷的治療效果[1-5，15]。本實驗研究也證實，白藜蘆醇預處理大鼠肺泡巨噬細胞后，能明顯抑制LPS誘導的炎癥因子TNF-α 的產(chǎn)生，并且其抑制作用呈劑量依賴性。

miRNAs是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，通過識別靶基因mRNA的3 端非編碼區(qū)來抑制靶蛋白的翻譯或促進靶基因的降解[16-17]。miRNAs通過抑制炎癥相關靶基因的轉錄表達，在炎癥反應調控中具有重要作用。miR-146a在TLRs/NF-κB通路中具有重要調控作用。它的靶基因是TLRs/NF-κB通路中的兩個重要接頭蛋白編碼基因IRAK-1和TRAF-6。miR-146a上調后將負性調控TLRs/NF-κB通路，能夠抑制炎癥介質的升高[6，18]。并且已證實miR-146a參與調節(jié)了LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應[7-8]。在本實驗中，用LPS刺激肺泡巨噬細胞后，也誘導了miR-146a的表達上調，與前者報道結果相似。

研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過影響miRNA前體的轉錄和miRNA的加工成熟，能特異性地引起一些miRNAs改變，包括miR-21、miR-146a、miR-663等，這些miRNAs都參與炎癥反應的調控[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇預處理大鼠肺泡巨噬細胞后，能明顯促進miR-146a的表達上調，并且相比于較低質量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導miR-146a的表達。

綜上所述，在LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應中，白藜蘆醇能夠抑制炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生，并上調miR-146a的表達，由此筆者可以推測，白藜蘆醇調控炎癥的機制之一可能是通過升高細胞內(nèi)miR-146a的表達水平來發(fā)揮其抗炎作用。

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（收稿日期：2013-05-07）

（本文編輯：鄭辛甜）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，009

基金項目：國家自然科學基金（81060152）；江西省自然科學基金（2009GZY0215）

作者單位：330006 南昌，南昌大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科（曾振國、邵強、丁成志、卿城、劉芬、詹以安、聶成、錢克儉），腫瘤科（李勇），影像科（龔洪翰）；南昌大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室（揭克敏）

通信作者：錢克儉，Email：qkj0607@sohu，com

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