硫化氫對大鼠心肺復蘇后心肌細胞凋亡的影響

謝學猛 潘昊 劉蓓蓓 陳娣 張錦程 楊光田

【摘要】目的 研究外源性硫化氫（H2S）對心肺復蘇后大鼠心肌細胞凋亡的影響。方法 雄性SD大鼠45只，隨機（隨機數(shù)字法）分3組，每組15只：假手術對照組（Sham）；常規(guī)復蘇組（CPR），經皮電刺激心外膜法制備心搏驟停模型，行常規(guī)復蘇； 硫氫化鈉組（NaHS），以NaHS為H2S供體，CPR開始前1 min靜脈給藥（總劑量5 mg/kg），其余操作同CPR組。記錄三組大鼠血流動力學指標變化。24 h后取左室心肌組織TUNEL法檢測心肌細胞凋亡；RT-PCR法檢測Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表達；ELISA法檢測血漿肌鈣蛋白T含量。三組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。結果 與CPR組比較， NaHS組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax增高（P<0，01），肌鈣蛋白T含量降低（P<0，05），心肌TUNEL陽性細胞比例降低（P<0，01）。與Sham組比較，CPR組和NaHS組心肌組織Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達不同程度增高（P<0，01）；與CPR組相比，NaHS組Caspase-3、Bax基因表達降低（P<0，01），Bcl-2基因表達增高（P<0，05）。結論 外源性H2S在心肺復蘇后24 h調節(jié)大鼠心肌Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表達，減輕心肌細胞凋亡，減少心肌標志物釋放，改善心功能。

【關鍵詞】心肺復蘇；心功能障礙；硫化氫；凋亡

Effects of hydrogen sulfide on apoptosis of cardiomyocytes after cardiopulmonary resuscitation in a rat model Xie Xuemeng，Pan Hao，Liu Beibei，Chen Di， Zhang Jincheng， Yang Guangtian. Emergency Department， Tongji Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China

Corresponding author： Yang Guangtian， Email： guangtiany@hotmail，com

【Abstract】Objective To explore the effects of hydrogen sulfide （ H2S）on apoptosis of cardiomyocytes after cardiopulmonary resuscitation （CPR） in rat models.Methods Forty-five male SD rats were randomly into sham group （n=l5）， CPR group （n=15） and NaHS group （n=15）. Rats of CPR group and NaHS group were operated to induce cardiac arrest by transcutaneous electrical stimulation to epicardium. In NaHS group， NaHS （5 mg/kg） was administrated via the femoral venous line 1 min before CPR. Hemodynamic variables were monitored and obtained continuously. Survival rats were sacrificed at 24 h after restoration of spontaneous circulation and the hearts were removed for analysis by RT-PCR and TUNEL assays. Blood samples were collected and plasma content of cTnT was detected.Results Compared with the CPR group， animals treated with NaHS had improved left ventricular function（P<0，01）， lower plasma cTnT levels（P<0，05）and decreased apoptosis index （P<0，01）24 h after ROSC. The expressions of Caspase-3 mRNA， Bax mRNA and Bcl-2 mRNA in CPR group and NaHS group were higher compared with the control group（P<0，01）. The NaHS group had lower expressions of Caspase-3 mRNA and Bax mRNA（P<0，01）， but higher expression of Bcl-2 mRNA（P<0，05）compared with the CPR group. Conclusions Exogenous （H2S） regulated the expressions of Caspase-3，Bax and Bcl-2 mRNA， thereby preventing apoptosis of cardiomyocytes， inhibiting cTnT release and improving left ventricular function 24 h after CPR.

【Key words】Cardiopulmonary resuscitation； Myocardial dysfunction； Hydrogen sulfide； Apoptosis

隨著心肺復蘇（CPR）技術的發(fā)展，心搏驟停（CA）患者自主循環(huán)恢復（ROSC）率已達20%～40%，但仍有50%～70%的ROSC患者在住院期間死亡[1-2]。復蘇后心功能不全是導致患者院內死亡的重要原因[3]。據(jù)報道，約30%的患者在復蘇成功后24 h內死于室性心律失?；蛐牧λソ遊4]。

研究發(fā)現(xiàn)，新型氣體信號分子硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）能夠減輕小鼠CA/CPR所致心肌損傷及心功能障礙[5]。筆者先前的研究也證實，H2S能夠提高心肌細胞缺氧耐受、減輕炎癥反應，從而減輕復蘇后大鼠心肌損傷[6]，但是其保護作用與心肌細胞凋亡的關系尚不清楚。因此，本實驗通過建立大鼠心肺復蘇模型，觀察心肌細胞凋亡變化及外源性H2S的干預作用，旨在探討H2S能否夠通過調控凋亡發(fā)揮心肌保護作用。

1 材料與方法

1，1 實驗儀器及試劑

RM6240BD型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)、HX-300小動物呼吸機（以上均購自成都泰盟科技有限公司）、PCR儀（eppendorf）、硫氫化鈉（sigma）、大鼠肌鈣蛋白T檢測試劑盒（abcam）、EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金生物技術有限公司）及TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1，2 方法

1，2，1 動物及分組 健康成年雄性SD大鼠45只，體質量300～400 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。術前12 h禁食禁水，腹腔注射苯巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，持續(xù)Ⅱ導連心電監(jiān)測。經口氣管插管，左側股動、靜脈分別置PE50導管用于血壓監(jiān)測和靜脈給藥。持續(xù)監(jiān)測肛門溫度，加熱燈泡使之維持在（36，5±0，5） ℃。動物隨機（隨機數(shù)字法）分為三組，每組15只：（1）假手術對照組（Sham），僅行麻醉和插管操作；（2）常規(guī)復蘇組（CPR），建立大鼠心搏驟停模型，行常規(guī)復蘇，予0，9%NaCl溶液靜脈輸注（16，6 mL/kg）；（3）NaHS組，以NaHS（0，3 mg/mL）為H2S供體，總劑量5 mg/kg，CPR開始前1 min經股靜脈予首劑量（0，5 mg/kg），后使用微量注射器泵入（1，5 mg·kg^-1·h^-1，×3 h），其余操作同CPR組。

1，2，2 CPR模型制備 經皮電刺激心外膜法建立大鼠心搏驟停模型[7]。分別于左側第三、右側第四肋間緊貼胸骨處經皮插入針灸針至心外膜，連接電極。電擊（直流電，2 mA起）開始后，大鼠血壓迅速降至25 mmHg （1 mmHg=0，133 kPa）以下，隨后出現(xiàn)呼吸停止、肢體抽搐等心搏驟停表現(xiàn)。持續(xù)電擊3 min防止大鼠自動除顫，停止電擊后心電圖可見室顫或無脈性電活動表現(xiàn)，無干預觀察3 min后開始搶救。胸外按壓采用自主研制的心肺復蘇機，按壓頻率200次/min，機械通氣（空氣）100次/min，潮氣量6 mL/kg。腎上腺素（20 μg/kg）每5 min使用一次。自主循環(huán)恢復（ROSC）定義為：心電恢復規(guī)則節(jié)律、MAP≥60 mmHg并持續(xù)10 min以上。按壓持續(xù)10 min自主循環(huán)未恢復視為復蘇失敗。注射完畢將動物縫合后放置籠中。

1，3 觀察指標

1，3，1 血流動力學指標 平均動脈壓、心率可由生理信號采集處理系統(tǒng)采集。復蘇后24 h，右側頸總動脈插管記錄LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax等心功能指標。

1，3，2 心肌TUNEL染色及凋亡分析 術后24 h取左心室壁心肌組織，4%多聚甲醛常溫固定包埋，切片、脫蠟，其余步驟按照說明書進行。顯微鏡下采集圖像，凋亡細胞細胞核顯色為棕褐色。每張切片隨機取 5個高倍鏡（400×）視野，分別計數(shù)陽性細胞核個數(shù)和細胞核總數(shù)，兩者比值定義為該切片凋亡指數(shù)。

1，3，3 心肌組織凋亡相關基因RT-PCR分析 Trizol法提取心肌組織總RNA，逆轉錄采用Fermentas試劑盒按照說明書進行。PCR擴增條件：（1）預變性，94 ℃ 10 min；（2）變性，94 ℃ 30 s；（3）退火，Bax基因64 ℃，其余58 ℃ 30 s；（4）延伸，72 ℃ 45 s；（5）充分延伸，72 ℃ 10 min。其中Bax基因擴增33個循環(huán)，其余基因皆為30個循環(huán)。引物序列見表1。PCR完成后行2%瓊脂糖凝膠電泳，照相后用Quantity one軟件灰度分析，以目的基因與β-actin基因的擴增產物條帶灰度值之比作為反映目的基因mRNA水平的相對指標。

1，3，4 血清肌鈣蛋白T含量測定 所有動物術后24 h于心尖處抽取動脈血，使用大鼠肌鈣蛋白T檢測試劑盒（雙抗夾心法），按照說明書進行。

1，4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 12，0軟件包進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0，05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2，1 各組大鼠一般情況及復蘇條件

各組大鼠一般情況和復蘇條件差異無統(tǒng)計學意義（P>0，05），見表2。CPR組和NaHS組分別有11只和12只大鼠復蘇成功，24 h后CPR組有10只存活，NaHS組全部存活。

2，2 ROSC后血流動力學參數(shù)比較

ROSC后3 h內CPR組和NaHS組的血壓和心率差異無統(tǒng)計學意義（P>0，05），見圖1。ROSC后24 h，NaHS組心功能指標LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標皆高于CPR組（P<0，01）（表3）。

2，3 血清肌鈣蛋白T質量濃度測定

24 h后CPR組和NaHS組血漿肌鈣蛋白T高于對照組（P<0，01），而NaHS組水平低于CPR組（P<0，05），見表3。

2，4 心肌TUNEL染色及凋亡分析

與對照組相比，CPR組和NaHS組TUNEL陽性細胞比例增高（P<0，01），NaHS組陽性心肌細胞比例則低于CPR組（P<0，01）。見圖2、圖3。

2，5 心肌組織凋亡相關基因RT-PCR分析

對照組僅有少量Caspase-3、Bax和Bcl-2表達。CPR組和NaHS組三種基因的表達量均增加（P<0，01）。與CPR組比較，NaHS組的Caspase-3、Bax表達降低（P<0，01），而Bcl-2表達升高（P<0，05）。見圖4、圖5。

3 討論

心肌是CA/CPR后缺血-再灌注損傷的主要靶器官之一，心肺復蘇后多有低血壓、心律失常和低心輸出量等表現(xiàn)。在本研究中，CPR組和NaHS組動物復蘇后平均動脈壓和心率明顯降低，ROSC后24 h血漿肌鈣蛋白T含量升高、心功能指標下降，這表明兩組大鼠在經歷CA/CPR后皆出現(xiàn)了明顯的心肌損傷和心肌功能障礙。ROSC后24 h，NaHS組血漿肌鈣蛋白T明顯低于CPR組，而 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax等心功能指標明顯優(yōu)于CPR組，證實了H2S對CA/CPR后大鼠心肌的保護作用。

目前已有多項研究發(fā)現(xiàn)復蘇后心肌組織中細胞凋亡及其相關因子表達的變化[8-10]。本研究在ROSC后24 h心肌細胞TUNEL凋亡檢測中觀察到大量陽性細胞，再一次證實凋亡參與復蘇后心肌功能障礙的病理生理過程。心肌細胞是人體的永久細胞，一旦凋亡將不能再生。據(jù)報道，慢性心力衰竭、急性心肌缺血等多種疾病都有心肌細胞凋亡發(fā)生并影響心臟泵血功能[11]，而凋亡潛在的可逆性也為這些疾病的治療提供了新的方向。

新型氣體信號分子H2S在心肌缺血-再灌注損傷中的作用已被廣泛證實[12-13]。H2S具有抗氧化、保護線粒體、調節(jié)炎癥反應等多種活性[14-15]，可以影響凋亡啟動和進展的多個環(huán)節(jié)，還可從整體上降低代謝率、提高缺氧耐受[16]，并在心肌缺血后適應中扮演重要角色[17]。因此，筆者推測，在心搏驟停后、CPR之前給予H2S供體NaHS可能減輕大鼠復蘇后心肌細胞凋亡。本研究結果顯示，NaHS組心肌細胞凋亡指數(shù)明顯低于CPR組，從而證實H2S可以在復蘇后24 h通過減輕心肌細胞凋亡而發(fā)揮心肌保護作用。

Caspase-3是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，其基因表達水平在CPR組和NaHS組明顯升高，表明復蘇后心肌細胞凋亡與Caspase-3基因上調相關。另有研究顯示，在不完全凋亡的情況下，激活的Caspase-3能夠降解心肌細胞內的多種結構和功能蛋白[18-19]，損傷心肌細胞收縮功能。本研究發(fā)現(xiàn)，NaHS組Caspase-3基因表達相比CPR組明顯降低，這提示H2S的抗凋亡作用可能與下調的Caspase-3有關，該效應可同時減少心肌結構蛋白分解，保護心肌收縮功能。

Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族中功能相反的兩個重要成員。當線粒體基質中的Bax與線粒體膜上的離子通道結合可引起線粒體通透性增加，促進凋亡發(fā)生。而錨定在線粒體外膜上的Bcl-2可與Bax結合致使后者活化受阻、抑制凋亡[20]。筆者觀察到，正常大鼠心肌組織內Bcl-2和Bax表達量很少，而在復蘇后大鼠的心肌組織內二者的表達量皆升高。NaHS組Bax表達明顯低于CPR組，Bcl-2表達則明顯提高。這表明，H2S的抗凋亡作用與其調節(jié)Bcl-2、Bax表達水平有關。

綜上所述，心肺復蘇后大鼠心肌細胞凋亡明顯增加，給予外源性H2S可以調節(jié)心肌組織 Caspase-3、Bax和Bcl-2基因表達，減輕心肌細胞凋亡，減少心肌標志物釋放，從而減輕復蘇后心肌損傷。

參考文獻

[1]Nolan JP， Laver SR， Welch CA， et al. Outcome following admission to UK intensive care units after cardiac arrest， a secondary analysis of the ICNARC Case Mix Programme Database [J] . Anaesthesia， 2007， 62（12） ： 1207-1216.

[2] Cerr BG， Kahn JM， Merchant RM， et al. Inter-hospital variability in post-cardiac arrest mortality [J] . Resuscitation， 2009， 8 （1） ： 30-34.

[3] Jerry PN，Robert WN， Christophe A， et al. Post-cardiac arrest syndrome： Epidemiology， pathophysiology， treatment and prognostication [J] . Resuscitation， 2008， 79（3） ： 350-379.

[4] Liang Chen L， Hao Tang H， Yan-bing Liang HB， et al. Expressions of SOCS-1 and SOCS-3 in the myocardium of patients with sudden cardiac death[J] . World J Emerg Med， 2010， 1（2）： 99-103.

[5] Shizuka M， Masahiko B， Patrick Y， et al. Hydrogen sulfide improves survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation via a nitric oxide synthase 3 -dependent mechanism in mice [J]. Circulation， 2009， 120（9） ： 888-896.

[6] 陳娣， 潘昊， 李醇文， 等. 硫化氫對心肺復蘇后大鼠心肌缺氧誘導因子-1a的影響 [J] . 中華急診醫(yī)學雜志， 2011， 7（20） ：687-691.

[7] Lin JY， Liao XX， Li H， et al. Model of cardiac arrest in rats by transcutaneous electrical epicardium stimulation [J] . Resuscitation， 2010， 81（9） ： 1197-1204.

[8]Gu W， Li CS， Yin WP， et al. Shen-Fu injection reduces postresuscitation myocardial dysfunction in a porcine model of cardiac arrest by modulating apoptosis [J] . Shock， 2012， 38（3） ： 301-306.

[9] Gu W， Li CS， Yin WP， et al. Apoptosis is involved in the mechanism of postresuscitation myocardial dysfunction in a porcine model of cardiac arrest [J] . Am J Emerg Med， 2012， 30（9）： 2039-2045.

[10]Lee JH， Suh GJ， Kown WY， et al. Protective effects of therapeutic hypothermia in post-resuscitation myocardium [J] . Resuscitation， 2012，83 （5） ： 633-639.

[11] Wang Y， Sun ZY， Zhang KM， et al. Bcl-2 in suppressing neuronal apoptosis after spinal cord injury[J]. World J Emerg Med， 2011， 2（1）： 38-44.

[12] Ahila S， Massimo C， Mohammed Y， et al. Antiapotosis and anti-inflammatory effects of hydrogen sulfide in a rat model of regional myocardial I/R [J] . Shock， 2009， 31（3） ： 267-274.

[13] Neel RS， Richard TC， Jun F， et al. The effects of therapeutic sulfide on myocardial apoptosis in response to ischemia-reperfusion injury [J] . Eur J Cardio-Thorac， 2008， 33（5） ： 906-913.

[14]Li JM， Zhang P， Zhao YN， et al. Protective effects of edaravone on diffuse brain injury in rats[J] . World J Emerg Med， 2011， 2（3）： 222-227.

[15] Elrod JW， Calvert JW， Morrison J， et al. Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by preservation of mitochondrial function[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104（39） ：15560-15565.

[16] Zhang C， Gao GR， Jiang HY， et al. Effects of environmental hypothermia on hemodynamics and oxygen dynamics in a conscious swine model of hemorrhagic shock[J] . World J Emerg Med， 2012， 3（2）： 128-134.

[17] Young QC， Lee SW， Foo CS， et al. Endogenous hydrogen sulphide mediates the cardioprotection induced by ischemic postconditioning [J] . Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2008， 295（3） ： 1330-1340.

[18] Communal C， Sumandea M， de Tombe P， et al. Functional consequences of caspase activation in cardiac myocytes [J] . Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99（9） ： 6252-6256.

[19] Moretti A， Weig HT， Ott T， et al. Essential myosin light chain as a target for caspase-3 in failing myocardium [J] . Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99（18） ： 11860-11865.

[20] Iyad MA， Jeejabai R， Rual JG， et al. Targeting mitochondria for resuscitation from cardiac arrest [J] . Crit Care Med， 2008， 36（11） ： 440-446.

（收稿日期：2013-04-23）

（本文編輯：邵菊芳）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，006

基金項目：國家自然科學基金（81071526）

作者單位：430030 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院急診科

通信作者：楊光田，Email： guangtiany@ hotmail，com

P19-23