以全燕麥為基質(zhì)的干酪乳桿菌Zhang固態(tài)發(fā)酵研究

史 燕，張淑麗，王海寬

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

以全燕麥為基質(zhì)的干酪乳桿菌Zhang固態(tài)發(fā)酵研究

史 燕，張淑麗，王海寬

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

以燕麥全粉為唯一基質(zhì)進(jìn)行干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) Zhang固態(tài)發(fā)酵，以期獲得一種具有益生元功效的谷物發(fā)酵食品．為了提高干酪乳桿菌的活菌數(shù)，對燕麥固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，選擇含水量、接種量、發(fā)酵時間和培養(yǎng)基初始pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件．結(jié)果表明：含水量55%、接種量9%、培養(yǎng)基初始pH 6、37,℃靜置培養(yǎng)36,h為最佳條件，此時干酪乳桿菌活菌數(shù)為6.32×109,,g-1，滴定酸度為9.93,mL，乳酸含量為0.45,g/100,g．對燕麥發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分進(jìn)行分析可知，發(fā)酵后β–葡聚糖含量為1.61,g/100,g，和發(fā)酵前相比幾乎沒有降低，α–氨基氮的含量增加了0.06,g/100,g，相對分子質(zhì)量小于6,000的多肽增加了10.62%．

燕麥；干酪乳桿菌；固態(tài)發(fā)酵；β-葡聚糖；多肽

益生菌具有抑制致病菌和腐敗菌、緩解乳糖不耐癥、防癌、抗突變、降低血清中膽固醇、預(yù)防胃腸道感染、抗腹瀉、增強(qiáng)免疫能力等生理功能，近幾年來一直備受人們的關(guān)注．而傳統(tǒng)益生菌產(chǎn)品多為發(fā)酵乳制品，但乳中富含脂肪和膽固醇，還可能引發(fā)乳糖不耐癥，不適合一些消費(fèi)者長期食用[1]．所以非乳益生菌食品已成為益生菌食品發(fā)展的重要趨勢[2]．

燕麥?zhǔn)枪任镏凶詈玫娜珒r營養(yǎng)食品．它具有含量相對較高的蛋白質(zhì)、不飽和脂類、維生素、抗氧化物質(zhì)和酚類，以及不同類型的膳食纖維，例如，β–葡聚糖、阿拉伯木聚糖和纖維素[3-4]．其中可溶性膳食纖維β–葡聚糖是主要的功能成分，具有降低血液中膽固醇的含量以及餐后血糖水平的作用[5]．同時，腸道微生物發(fā)酵β–葡聚糖(作為一種益生元)后會形成短鏈脂肪酸，從而保護(hù)結(jié)腸膜[6]．研究已經(jīng)證明，燕麥適用于益生菌發(fā)酵，且在發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生一些易于人體機(jī)體吸收的有益成分．Loponen等[7]在燕麥發(fā)酵的過程檢測了燕麥球蛋白可溶性以及水解性的

變化，表明在燕麥發(fā)酵中蛋白作為燕麥的結(jié)構(gòu)成分可以被水解而提供具有香味和活性肽的產(chǎn)物. 葛磊等[8]用中溫α–淀粉酶、糖化酶對燕麥進(jìn)行雙酶水解，得到的糖化液配以脫脂奶粉，進(jìn)行殺菌，冷卻后再以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑進(jìn)行接種發(fā)酵，制備出一種含有活性成分且具有保健功能的生物乳飲料．Angelov等[9]利用乳酸菌發(fā)酵全粒燕麥獲得了一種含有β–葡聚糖益生功效的飲料．

目前，市場上以燕麥為主要原料的益生菌產(chǎn)品較多，但多添加各種糖類，不適宜高血脂、高血糖等人群長期食用，而以燕麥全粉作為益生菌唯一載體的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品國內(nèi)外仍未見報道．同時，固態(tài)發(fā)酵較液態(tài)發(fā)酵具有工藝簡單、無污染、成本低、易推廣、對環(huán)境和設(shè)備要求低的優(yōu)勢．干酪乳桿菌Zhang是分離自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中的一株益生菌．該菌株的耐酸性、人工胃腸液和膽鹽耐受性良好[10]，并且，大量的實(shí)驗(yàn)研究表明其具有顯著的降血脂和免疫調(diào)節(jié)作用[11-12]．因此，本研究旨在以燕麥全粉為唯一基質(zhì)進(jìn)行干酪乳桿菌Zhang固態(tài)發(fā)酵特性的研究，以期獲得一種具有益生元功效的谷物發(fā)酵食品．

1 材料與方法

1.1 原料、菌種及試劑

燕麥，市售，搗碎機(jī)搗碎成粉末，過20目篩．

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)Zhang，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室．

蛋白胨、牛肉膏均為生化試劑；Tween 80為化學(xué)純；葡萄糖、檸檬酸三銨、乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O和MnSO4·4H2O等均為分析純試劑．

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10,g，牛肉膏10,g，酵母膏5,g，K2HPO42,g，檸檬酸三銨2,g，乙酸鈉2,g，葡萄糖20,g，MgSO4·7H2O 0.5,g，MnSO4·4H2O 0.25,g，Tween,80 1,mL，蒸餾水1,L，pH 6.5，115,℃滅菌20,min．

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基．

燕麥固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：向燕麥粉中加入一定量的水，然后用玻璃棒攪拌均勻，配制成初始含水量不同的燕麥培養(yǎng)基，115,℃滅菌20,min．

1.3 菌種的活化

取少量保存于甘油管內(nèi)的干酪乳桿菌Zhang于 MRS瓊脂平板上劃線，挑取單菌落用MRS固體斜面培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化傳代，從活化的MRS固體斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體接入MRS液體培養(yǎng)基中，37,℃靜置培養(yǎng)20,h，然后將活化的菌液按V(菌液)/V(培養(yǎng)基)＝5%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，37,℃靜置培養(yǎng)16,h，制成種子液．

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含水量對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響

對不同初始含水量(m(水)/m(培養(yǎng)基)＝50%、55%、60%、65%)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，接種量為8%，37,℃靜置培養(yǎng)24,h后，分別對以上固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)體系進(jìn)行干酪乳桿菌活菌計(jì)數(shù)，每組處理重復(fù)3次．

1.4.2 接種量對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響

在上述確定的含水量的基礎(chǔ)上，其他條件不變，對不同接種量(m(菌液)/m(培養(yǎng)基)＝5%、8%、10%、11%)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別對以上固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)體系進(jìn)行干酪乳桿菌活菌計(jì)數(shù)，每組處理重復(fù)3次．

1.4.3 發(fā)酵時間對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響

在上述確定的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，其他條件不變，對培養(yǎng)時間(12、24、36、48,h)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別對以上固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)體系進(jìn)行干酪乳桿菌活菌計(jì)數(shù)，每組處理重復(fù)3次．

1.4.4 培養(yǎng)基初始pH對植物乳桿菌活菌數(shù)的影響

在上述確定的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，其他條件不變，對培養(yǎng)基初始pH(5.5、6.0、6.5、7.0)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別對以上固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)體系進(jìn)行干酪乳桿菌活菌計(jì)數(shù)，每組處理重復(fù)3次．

1.4.5 干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵燕麥優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇各因素的3個最佳水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)．

1.5 檢測方法

1.5.1 干酪乳桿菌Zhang活菌檢測

稱取10,g燕麥固體發(fā)酵樣品置于裝有90,mL無菌生理鹽水的勻漿杯中，勻漿15,s，制成1∶10的樣品勻液．然后梯度稀釋，選擇合適稀釋度按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35—2010進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[13]．

1.5.2 pH和總酸度(TTA)的測定

根據(jù)AACC(2000)02-52方法[14]，稱取10,g燕麥固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，放入錐形瓶中，加入90,mL無CO2的蒸餾水，用磁力器攪拌30,min，靜置10,min后用pH計(jì)測定新鮮曲料的pH；并用0.1,mol/L NaOH溶液滴定，用pH計(jì)測定滴定終點(diǎn)pH 8.6．所需0.1,mol/L NaOH溶液的體積(單位為mL)即為總酸度．重復(fù)3次取平均值.

1.5.3 固態(tài)發(fā)酵前后成分含量的測定

可溶性膳食纖維含量的測定按照AACC32-07方法[15]；β–葡聚糖含量的檢測按照AOAC995.16方法[16]；α–氨基氮的測定采用茚三酮顯色法[17]；乳酸含量利用生物傳感儀進(jìn)行測定．

1.6 燕麥多肽樣品的制備

取燕麥發(fā)酵樣品10,g，勻漿器破碎后，將所得發(fā)酵物用5倍無菌生理鹽水在4,℃浸提4,h，在4,500,r/min條件下離心取上清液，冷凍干燥后取粉末2.0,g，加水50,mL充分溶解，3,000,r/min離心15,min，取上清液，經(jīng)0.45,μm微孔濾膜過濾．另有未接種固態(tài)發(fā)酵物作為空白對照．

1.7 多肽相對分子質(zhì)量分布的測定[18]

色譜條件：色譜柱為GE SuperdexTMPeptide 10/300GL(10,mm×300,mm)凝膠柱；流動相為50,mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH,7.2，含0.15,mol/L NaCl)；柱壓小于1.8,MPa；流量0.7,mL/min；檢測波長214,nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10,μL．以細(xì)胞色素C(Mr＝12,500)、抑肽酶(Mr＝6,512)、氧化性谷胱甘肽(Mr＝615)、還原谷胱甘肽(Mr＝310)、甘氨酸(Mr＝75)為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品．

2 結(jié)果與討論

2.1 干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵燕麥培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 含水量對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響

初始含水量對干酪乳桿菌Zhang固態(tài)發(fā)酵燕麥活菌數(shù)的影響見圖1．

由圖1可知，含水量達(dá)到55%時，干酪乳桿菌Zhang活菌數(shù)最高，為3.24×109g-1．

2.1.2 接種量對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響

接種量對干酪乳桿菌Zhang固態(tài)發(fā)酵燕麥活菌數(shù)的影響見圖2．

由圖2可知：接種量從5%增大到10%，干酪乳桿菌Zhang活菌數(shù)隨之遞增；當(dāng)接種量為10%時，活菌數(shù)最高，為4.13×109g-1．

2.1.3 發(fā)酵時間對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響

不同發(fā)酵時間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3．

由圖3可知：在一定范圍內(nèi)，干酪乳桿菌Zhang活菌數(shù)隨著發(fā)酵時間的延長而遞增；當(dāng)發(fā)酵時間為36,h時，活菌數(shù)最高，為6.17×109,g-1．

2.1.4 培養(yǎng)基初始pH對干酪乳桿菌活菌數(shù)的影響

不同初始pH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4．

由圖4可知，培養(yǎng)基初始pH對干酪乳桿菌Zhang活菌數(shù)有一定的影響，當(dāng)pH為6.0或6.5時，活菌數(shù)分別為6.17×109g-1和6.18×109g-1，差別不明顯，但比pH為5.5和7.0的活菌數(shù)都高．

2.2 正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)條件

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇各因素的3個最佳水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1．

由表1可知：對干酪乳桿菌Zhang活菌數(shù)影響的主次順序是發(fā)酵時間＞含水量＞pH＞接種量；理論最佳組合為：含水量55%、接種量9%、發(fā)酵時間36,h、培養(yǎng)基初始pH,6．

在此優(yōu)化條件下培養(yǎng)干酪乳桿菌Zhang，經(jīng)驗(yàn)證，其活菌數(shù)為(6.32±0.14)×109,g-1，相比于未優(yōu)化前的活菌數(shù)有所提高，也高于正交實(shí)驗(yàn)中的各個組合條件下的活菌數(shù)．

2.3 發(fā)酵過程中pH和總酸度變化

發(fā)酵過程中pH和總酸度變化見圖5．

由圖5可以看出：在最初的0～4,h的發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，燕麥培養(yǎng)基的pH由原來的5.67迅速下降到4.75左右；4,h以后，pH只是輕微的變化；當(dāng)32,h以后，pH為4.13并保持不變．總酸度隨著發(fā)酵時間的延長而增加，這是由于干酪乳桿菌Zhang產(chǎn)酸，酸不斷積累導(dǎo)致酸度上升，當(dāng)發(fā)酵到36,h時，總酸度達(dá)到9.93,mL．

2.4 發(fā)酵前后燕麥成分的變化

將優(yōu)化后得到的燕麥固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行成分變化分析，結(jié)果見表2、表3．

由表2可知：可溶性膳食纖維由發(fā)酵前的2.19,g/ 100,g變?yōu)?.08,g/100,g，變化不顯著；大部分的β–葡聚糖屬于可溶性膳食纖維，其含量由發(fā)酵前1.63,g/100,g變?yōu)?.61,g/100,g，幾乎沒有降低，這可能是由于干酪乳桿菌對β–葡聚糖降解能力差造成的；α–氨基氮的含量由0.11,g/100,g上升至0.17,g/100,g，同時，產(chǎn)生的乳酸量為0.45,g/100,g．β–葡聚糖能夠降低血糖、降低血脂，具有極好的保健作用．燕麥中β–葡聚糖含量居于谷物之首，故固態(tài)發(fā)酵完的燕麥產(chǎn)品仍具有降血糖和降血脂的保健作用．

將色譜數(shù)據(jù)用GPC數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行計(jì)算，即可得到樣品中多肽的相對分子質(zhì)量分布范圍(表3)．從表3中可以看出：在干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵燕麥36,h后，與空白對照組作比較，相對分子質(zhì)量大于10,000的多肽(蛋白質(zhì))含量降低了56.33%，相對分子質(zhì)量小于6,000的多肽增加了10.62%，其中，相對分子質(zhì)量在3,000～6,000的多肽含量增加了3.29%，相對分子質(zhì)量在1,000～3,000的多肽含量增加了

36.85%，相對分子質(zhì)量小于1,000的小分子肽含量增加了6.36%．而生物活性肽(BAP)指的正是一類相對分子質(zhì)量小于6,000的多肽，其在體內(nèi)吸收快，利用率高，并且營養(yǎng)豐富，具有抗高血壓，抗血栓形成、降血糖、抗癌、抗衰老、防止肝硬化等多種功能[19]. 實(shí)驗(yàn)表明，干酪乳桿菌Zhang發(fā)酵燕麥的過程中菌體會分泌蛋白酶，可使蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生小分子的肽類和氨基酸，有利于人體更好地吸收．

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選取了可能影響干酪乳桿菌Zhang固態(tài)發(fā)酵燕麥活菌數(shù)的含水量、接種量、發(fā)酵時間以及培養(yǎng)基的初始pH進(jìn)行單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到了最優(yōu)發(fā)酵條件：含水量55%、接種量9%、發(fā)酵時間36,h、培養(yǎng)基初始pH 6，在此條件利用燕麥為唯一基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵所得干酪乳桿菌Zhang活菌數(shù)為6.32× 109,g-1，總酸度為9.93,mL．

對比發(fā)酵前后燕麥基質(zhì)成分的變化，作為可溶性膳食纖維的主要成分的β–葡聚糖含量幾乎沒有降低；乳酸含量為0.45,g/100,g；α–氨基氮的含量增加了0.06,g/100,g；相對分子質(zhì)量小于6,000的多肽增加了10.62%．

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責(zé)任編輯：常濤

Whole Oat Solid-state Fermentation with Lactobacillus casei Zhang

SHI Yan，ZHANG Shuli，WANG Haikuan
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

In this study，the whole oat powder was used as the only medium for the solid-state fermentation with Lactobacillus casei Zhang for the purpose of developing a fermented grain food with prebiotic effect. In order to obtain the high viable count of L. casei Zhang，the optimal fermentation conditions were obtained through single factor tests and the orthogonal tests of the moisture content，inoculum size，fermentation time and the initial pH of the medium. In the optimal conditions(moisture content 55%，inoculum size 9%，pH 6，fermentation 36,h and under 37,℃)，the highest population was 6.32× 109,g-1，the titratable acidity was 9.93,mL and the amount of lactic acid was 0.45,g/100,g. By analyzing the nutrition compositions of the oat before and after fermentation，the following conclusions could be made. Almost no change was seen in the β-glucan content，which was 1.61,g/100,g after fermentation；the content of α-ammonia nitrogen and peptide whose relative molecular weight is less than 6,000,increased by 0.06,g/100,g and 10.62%，respectively.

oat；Lactobacillus caseiZhang；solid-state fermentation；β-glucan；peptide

TS213.2

A

1672-6510(2014)06-0016-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.004

2014–03–29；

2014–06–11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30900961)

史 燕（1986—），女，河北人，碩士研究生；通信作者：王海寬，教授，hkwang@aliyun.com.