前列腺癌超聲微泡介導(dǎo)藥物及基因治療研究進(jìn)展

劉 蕓 趙 云△ 劉朝奇 胡 兵

前列腺癌是男性高發(fā)的惡性腫瘤之一。常規(guī)去激素治療前列腺癌后多在12～18個月內(nèi)發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌（androgen-independent prostate carcinoma，AIPC），目前臨床上對AIPC缺乏有效的治療方法。隨著分子生物學(xué)和基因技術(shù)的發(fā)展，基因治療顯得極具優(yōu)勢。然而，同其他腫瘤的基因治療一樣，前列腺癌離體細(xì)胞或動物實驗基因治療效果不盡理想，主要原因之一是缺乏安全高效的活體內(nèi)基因運送載體。目前常用的非病毒載體存在轉(zhuǎn)染率低等問題，病毒載體雖轉(zhuǎn)染效率高，卻存在安全性低、免疫原性高、靶向性差等缺點。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡造影劑可作為一種新型的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染載體，用于前列腺癌的治療研究，并有望為前列腺癌患者提供一種安全、高效的治療方法[1]。本文就載藥微泡在前列腺癌治療中的應(yīng)用綜述如下。

1 超聲微泡造影劑

超聲微泡造影劑因具有回波反射性而應(yīng)用于組織增強(qiáng)顯影,又因能促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)胞和組織中的轉(zhuǎn)運，而被用作基因運載體。其主要由內(nèi)充氣體和外殼構(gòu)成，內(nèi)充氣體現(xiàn)多采用低溶解度的氣體，如氟碳?xì)怏wC3F8、C4F10或氟硫氣體SF6，其在血液中的循環(huán)時間及穩(wěn)定性明顯高于空氣核心的納米級超聲微泡；外殼多由糖類、變性的白蛋白、磷脂、聚合物或上述物質(zhì)混合而成[2]。

2 超聲微泡的靶向性作用

超聲微泡可成為理想的藥物或基因載體的主要原因是，其可定向到達(dá)特定部位而發(fā)揮作用。超聲微泡的這一特性被稱為靶向性作用。而根據(jù)其實現(xiàn)靶向的機(jī)制和部位不同，可將其靶向作用分為被動型和主動型。被動型靶向是指通過機(jī)體本身的免疫－吞噬細(xì)胞在調(diào)理素的協(xié)同作用下實現(xiàn)對異物（超聲微泡）的清除；主動型靶向是指通過對超聲微泡的外殼進(jìn)行特殊處理，如在其外殼表面裝配具有靶向性識別的各種配體（如抗體、糖類、多肽類），此類配體能特異性識別并結(jié)合病變組織細(xì)胞所表達(dá)的受體，從而達(dá)到靶向顯影，載藥、載基因靶向治療的目的[3]。

超聲微泡靶向性作用是其作為載體應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)，為提高超聲微泡的靶向性，國內(nèi)外學(xué)者做出了各方面的嘗試。Maul等[4]提出了雙重靶向的概念，在微泡上插入一個快速定位配體和一個穩(wěn)定性好、親和力高的緩慢定位配體,在提高微泡黏附率的同時，增強(qiáng)了微泡抗脫落的能力。Sun等[5]合成了陽離子超聲微泡（cationic microbubble,CMB），其攜AKT基因轉(zhuǎn)染缺血性心肌病的能力較普通微泡提高了近70%，經(jīng)其治療后，心肌梗死范圍明顯縮小，心肌細(xì)胞凋亡率降低，心肌內(nèi)微血管密度增加。Yan等[6]利用生物素－親和素連接方式將紫杉醇與脂質(zhì)微泡結(jié)合起來，制備了紫杉醇-脂質(zhì)微泡。該微泡在超聲輻照下可靶向作用于腫瘤，有效地促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，限制了腫瘤的生長。

3 超聲微泡攜藥物治療的作用機(jī)制

3.1 聲孔效應(yīng) 聲孔效應(yīng)是超聲微泡靶向治療的物理基礎(chǔ)。微泡在超聲激發(fā)下出現(xiàn)震蕩或內(nèi)爆，并伴隨產(chǎn)生高速微束射流、巨大切應(yīng)力和沖擊波等，致使細(xì)胞膜的完整性遭到破壞。在細(xì)胞膜甚至核膜上產(chǎn)生直徑約為50 nm暫時性、可逆性的小孔，此即聲孔效應(yīng)。這些小孔可以允許分子質(zhì)量在10～3 000 ku的物質(zhì)通過細(xì)胞膜或核膜。在高強(qiáng)度超聲輻射或微泡濃度較高時，這種小孔可成變?yōu)橛谰眯缘男】?，使得?xì)胞內(nèi)外滲透壓改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，此即為致死性聲孔效應(yīng)[7]。

3.2 空化效應(yīng) 細(xì)胞膜通透性改變是基因轉(zhuǎn)染的前提。超聲在輻照中所產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)可增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，尤以空化效應(yīng)為主。空化效應(yīng)分為穩(wěn)態(tài)空化和瞬態(tài)空化。后者是一種強(qiáng)烈的生物效應(yīng)，在增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染的同時，甚至?xí)鸺?xì)胞凋亡、壞死。Bazan-Peregrino等[8]的研究顯示，超聲的空化效應(yīng)可使毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬和細(xì)胞膜通透性增加，從而使得微泡或釋放的基因能夠進(jìn)入血管壁及組織間隙，發(fā)揮靶向治療作用。

3.3 其他作用 Meijering等[9]提出，超聲輻射下微泡破裂，導(dǎo)致過氧化氫大量生成，同時引起鄰近細(xì)胞膜Ca2+內(nèi)流、Ca2+依賴性K+通道開放，從而致使局部膜電位發(fā)生超極化，該機(jī)制介導(dǎo)超聲微泡通過內(nèi)吞作用和胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Tran等[10]研究結(jié)果顯示，超聲微泡破裂產(chǎn)生的壓力可形成一種機(jī)械性刺激，活化特定通道(牽張激活通道)和非特異性離子通道，使外源性分子（如含轉(zhuǎn)染基因或藥物的微泡）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮作用。

4 超聲微泡介導(dǎo)藥物治療前列腺癌的研究進(jìn)展

4.1 超聲微泡介導(dǎo)與腫瘤細(xì)胞凋亡 Li等[11]在超聲引導(dǎo)下用磷脂微泡攜帶羥基喜樹堿作用于腫瘤小鼠。Fan等[12]利用超聲輻照下攜載survivin siRNA的納米級微泡治療前列腺癌，通過基因沉默抑制survivin在前列腺癌C4細(xì)胞及DU-145細(xì)胞中的表達(dá)，而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，達(dá)到顯著的抑癌效果。Kim等[13]發(fā)現(xiàn)，對前列腺癌小鼠進(jìn)行超聲微泡結(jié)合放射性治療，腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增加。

4.2 超聲微泡介導(dǎo)與腫瘤新生血管的損傷 腫瘤的迅速生長依賴于從新生血管內(nèi)獲取足夠多的營養(yǎng)。腫瘤新生血管內(nèi)皮會表達(dá)大量的黏附分子受體、生長因子受體（如整合素αvβ3和血管內(nèi)皮生長因子）等，它們在腫瘤毛細(xì)血管及細(xì)胞中表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)甚微，因此，其可作為微泡治療腫瘤的良好靶點。Anderson等[14]將環(huán)狀五肽cRGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）連接在微泡表面制成cRGD-MB，以靶向結(jié)合αvβ3整合素,與對照組相比，cRGD-MB組具有顯著吸附αvβ3整合素的能力，靶向作用于腫瘤的能力更強(qiáng)。Negi? shi等[15]從層黏連蛋白a1鏈中分離得到了含12個氨基酸的AG73多肽鏈，合成了AG73脂質(zhì)超聲微泡（AG73-Bubble li?posomes，AG73-BLs）,AG73-BLs能與腫瘤血管內(nèi)皮中高表達(dá)的硫酸類肝素蛋白多糖（syndecan-2）特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)定向黏附腫瘤血管內(nèi)皮的作用,AG73-BLs組較未標(biāo)記組或其他微泡修飾組，靶向性更強(qiáng)，且持續(xù)作用時間可達(dá)4 min。Hwang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡造影劑在低頻超聲輻照下會損傷腫瘤新生血管內(nèi)皮，并激活內(nèi)源性和外源性凝血，誘發(fā)血管內(nèi)血栓形成，栓塞毛細(xì)血管，引起局部腫瘤組織缺血、壞死。

4.3 超聲微泡介導(dǎo)與藥物的運輸 超聲微泡在靶向治療腫瘤獨具優(yōu)勢主要體現(xiàn)在兩個方面，一是高特異性(通過配體-受體結(jié)合)地將基因或藥物運送至腫瘤部位，二是在特定參數(shù)的超聲輻照可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的攝取，這點在化療中尤為重要。Jackson等[17]將超聲參數(shù)設(shè)定為4 MHz和平均聲強(qiáng)為32 W/cm2時，腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞對親水性微泡造影劑（若丹明R123，親水性阿霉素和甘露醇）和疏水性微泡造影劑（若丹明R6G和紫衫醇）的攝取率均升高，由納米微粒封閉紫杉醇的吸收率近達(dá)100%。Bai等[18]將超聲參數(shù)設(shè)定為21 kHz、聲強(qiáng)為4.6 mW/cm2時，脂質(zhì)微泡＋pEGFP+超聲組中，pEGFP DNA對PC-3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率達(dá)到了20.30%，其轉(zhuǎn)染率為pEGFP直接轉(zhuǎn)染組的81倍。Liu等[19]在對兔前列腺癌進(jìn)行超聲輻照下微泡治療（microbubble-enhanced thera?peutic ultrasound，MEUS）后，注射伊文斯藍(lán)（Evans blue，EB）和硝酸鑭（lanthanum，La），并計算EB及La在腫瘤組織中的滲出率，以評估MEUS治療前列腺癌的效果。結(jié)果顯示，在激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM)下EB滲出率增加，并廣泛分布于微血管基質(zhì)及腺上皮。透射電子顯微鏡（TEM）顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接被打開，并見La在基質(zhì)和腺上皮分布。該實驗表明MEUS可以提高前列腺癌的滲出率，并能打開血-前列腺癌屏障。

5 問題與展望

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，超聲微泡可通過各種修飾、裝配，而成為介導(dǎo)前列腺癌基因治療的主要工具。但目前這些研究大都處于臨床前的動物實驗階段，在其進(jìn)入臨床試驗之前仍需解決以下問題：（1）微泡制備技術(shù)及將藥物、基因或配體連接至微泡上的技術(shù)尚不成熟。微泡攜帶基因或藥物量有限，同時，微泡在血管內(nèi)運輸時因血液具有流動性與沖擊性，導(dǎo)致微泡與受體接觸時間短，靶向微泡-受體對形成數(shù)量不足，往往處于治療閾值以下。（2）超聲微泡爆裂時，除了能使血管內(nèi)皮間隙增寬而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染外，還可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板激活、血管內(nèi)溶血等不良反應(yīng)。（3）超聲參數(shù)設(shè)定對于微泡的轉(zhuǎn)染率有一定的影響，但仍未形成最優(yōu)參數(shù)。

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