黑龍江省馬鈴薯主栽品種遺傳多樣性的RAPD分析

趙光磊，張雅奎，吳凌娟，徐學譜，刁琢，

李功義1，梁杰1，董傳民1，溫福軍1，呂文河2*

（1.黑龍江省大興安嶺地區(qū)農(nóng)林科學院，黑龍江加格達奇165000；2.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030)

遺傳育種

黑龍江省馬鈴薯主栽品種遺傳多樣性的RAPD分析

趙光磊1，張雅奎1，吳凌娟1，徐學譜1，刁琢1，

李功義1，梁杰1，董傳民1，溫福軍1，呂文河2*

（1.黑龍江省大興安嶺地區(qū)農(nóng)林科學院，黑龍江加格達奇165000；2.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150030)

應用RAPD標記技術對黑龍江省34份馬鈴薯主栽品種的遺傳多樣性進行分析，明確這些主栽品種的親緣關系，旨在為本區(qū)域馬鈴薯優(yōu)良品種的選育提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，34條隨機引物共擴增出條帶185條，其中多態(tài)性條帶135條，占總條帶數(shù)的73%；34份供試品種可聚為3大類7亞類，遺傳距離在0.112～0.551之間，平均為0.364。結(jié)果表明，黑龍江省馬鈴薯主栽品種的遺傳相似性較高，遺傳基礎比較狹窄。

馬鈴薯；RAPD分析；遺傳多樣性；黑龍江省

DNA分子標記技術（如SSR，RAPD，ISSR和SPAR等）是進行種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析的重要手段[1-4]，其中RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)作為一種快速、簡便和通用性好的分子標記技術，一經(jīng)問世，便得到了廣泛應用，目前，已成為生物遺傳多樣性研究的重要技術之一，尤其在馬鈴薯遺傳多樣性研究方面有很多報道，如楊先泉等[5]、劉福翠等[6]和邸宏等[7]分別研究了四川省、云南省和中國部分馬鈴薯品種的遺傳多樣性。然而，現(xiàn)有報道中多是對引進或育成多年的馬鈴薯品種進行分析，隨著近年來新育成品種在黑龍江省的推廣和種植，有必要針對黑龍江省馬鈴薯現(xiàn)有主栽品種的遺傳多樣性進行分析。為此，本研究應用RAPD分子標記技術對黑龍江省34份馬鈴薯主栽品種的遺傳多樣性進行了分析，旨在進一步了解這些品種的遺傳特性，以期為本省馬鈴薯種質(zhì)資源的利用和雜交育種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為34份黑龍江省馬鈴薯的主栽品種（表1），由黑龍江省大興安嶺地區(qū)農(nóng)林科學院提供。Taq DNA聚合酶和dNTP為BioTeke公司產(chǎn)品；RAPD引物由上海生工生物技術公司合成；其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純化。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取各供試材料的幼嫩葉片，用植物基因組試劑盒（購自百泰克生物技術有限公司）提取DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度化。

表1 34份供試馬鈴薯品種Table 1Thirty-four potato varieties used in this study

1.2.2 RAPD反應

PCR反應體系為25 μL，其中含有1×buffer，0.12 mmo1∕L dNTPs，0.8 μmo1∕L隨機引物，1.5 mmo1∕L Mg2+，1 U Taq DNA酶，40 ng模板DNA。

在工業(yè)自動化控制技術市場中，需求和供應之間存在供需矛盾的問題。需方需求的是完整的自動控制體系，以滿足自身制造工藝需要，而國內(nèi)大多供應商提供的是各種標準化器件產(chǎn)品，不構(gòu)成完整的控制體系，這極大的影響了我國企業(yè)自動化技術的發(fā)展。尤其是經(jīng)濟全球化發(fā)展的趨勢下，國際間的經(jīng)濟貿(mào)易往來十分頻繁，我國的制造業(yè)面臨著國內(nèi)外雙重競爭壓力，低水平的自動化控制技術已經(jīng)難以滿足我國制造業(yè)競爭力提升的需求。

PCR反應程序為94℃預變性4min，94℃變性30s，37℃復性40 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色觀察后，在紫外燈下照相記錄。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

將電泳圖譜上有帶的記為1，無帶和模糊條帶的記為0。根據(jù)RAPD數(shù)據(jù)使用NTSYS-pc2.10軟件，采用Nei和Li[8]的方法計算遺傳距離，并用非加權組對平均聚類法（UPGMA）進行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD標記的多態(tài)性分析

以34份馬鈴薯品種的基因組DNA為模板，利用RAPD反應體系進行引物的篩選，從80條引物中篩選出穩(wěn)定性好、條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物34條，用于品種間的比較分析。利用34個多態(tài)性引物共擴增出DNA帶185條，其中多態(tài)性條帶135條，占總條帶的73%（表2）。其中擴增多態(tài)性條帶最多的引物為S376和S265，多態(tài)性條帶為8條（圖1）。

2.2 34份馬鈴薯品種的遺傳距離

根據(jù)擴增的多態(tài)性條帶，利用NTSYS軟件計算供試材料間的遺傳距離，結(jié)果表明，34份馬鈴薯品種之間的遺傳距離在0.112～0.551之間，平均為0.364。其中成對遺傳距離小于0.4的品種對有385個，占總數(shù)的68.63%，而成對遺傳距離大于0.5的品種對僅為1.25%（圖2）。上述結(jié)果說明，黑龍江省馬鈴薯栽培品種的遺傳距離狹窄，遺傳相似性較高，遺傳多樣性程度較低。

表2 不同隨機引物擴增出34份馬鈴薯品種的條帶數(shù)Table 2Numbers of DNA fragments amplified with different primers in 34 potato varieties

圖1 引物S376擴增的RAPD圖譜Figure 1Profile of amplified RAPD using primer S376

圖2 34份馬鈴薯品種間的成對遺傳距離分布圖Figure 2Frequency distribution of pairwise genetic distance of 34 potato varieties

2.3 34份馬鈴薯品種的聚類分析

應用UPGMA方法和NTSYS軟件對RAPD結(jié)果建立聚類樹狀圖（圖3）。從圖3可知，試供的34個品種可劃分為3大類，I類包括7個品種，Ⅱ類包括25個品種，Ⅲ類僅包括2個品種。

I類可分為3個亞類：I-1亞類包括2個品種，即‘底西芮’和‘夏波蒂’。I-2亞類有4個品種，包括‘麻皮布爾斑克’、‘大西洋’、‘東農(nóng)305’和‘東農(nóng)306’。I-3亞類僅有1個品種，即‘東農(nóng)309’。

圖3 34份馬鈴薯品種的聚類分析Figure 3Dendrogram of 34 potato varieties by using UPGMA analysis

Ⅱ類在相似系數(shù)為0.65處，又分為3個亞類：Ⅱ-1亞類有19個品種，其中又可分為4個亞亞類，Ⅱ-1-1包括‘諾蘭’、‘興佳2號’、‘費烏瑞它’、‘克新22號’、‘訥引4號’和‘訥引5號’；Ⅱ-1-2包括‘中薯5號’和‘東農(nóng)303’；Ⅱ-1-3包括‘超白’、‘春薯1號’、‘早大白’、‘興安紅’、‘東農(nóng)308’和‘中大1號’；Ⅱ-1-4包括‘克新12號’、‘克新19號’、‘訥引1號’、‘尤金’和‘克新23號’。Ⅱ-2亞類有3個品種，即‘花園525’、‘東農(nóng)307’和‘克新13號’。Ⅱ-3亞類有3個品種，即‘213’、‘克新18號’和‘克新4號’。

Ⅲ類僅包括2個品種‘訥引2號’和‘訥引3號’。

從聚類結(jié)果可以看出，國外育成品種或具有國外品種血緣的品種多聚在相同類群，如‘底西芮’、‘夏波蒂’、‘麻皮布爾斑克’、‘大西洋’、‘東農(nóng)305’、‘東農(nóng)306’和‘東農(nóng)309’均聚在I類?！Z蘭’、‘興佳2號’和‘費烏瑞它’也聚在Ⅱ-1-1中。

3 討論

研究結(jié)果表明，在80個隨機引物中篩選出的34個引物能在34份馬鈴薯品種間擴增出較好的多態(tài)性片段，共擴增出條帶185條，其中多態(tài)性條帶135條，占總條帶數(shù)的73%。分子聚類分析表明，34份馬鈴薯品種可聚為3大類7亞類。遺傳距離分析表明，黑龍江省34份馬鈴薯主栽品種之間的遺傳距離在0.112～0.551之間，平均為0.364，成對遺傳距離小于0.4的品種對占總數(shù)的68.63%。結(jié)果表明：黑龍江省馬鈴薯栽培品種的遺傳相似性較高，遺傳基礎比較狹窄，遺傳多樣性總體水平較低。

有報道認為，RAPD技術由于受反應條件的影響很大，假陽性率高，重復性較差，影響結(jié)果的準確性[9]，但筆者認為，只要嚴格地控制試驗條件，規(guī)范地進行試驗操作，增加試驗重復次數(shù)，是可以克服上述缺點的。前人的研究也證明，RAPD技術用于資源評價是有效可靠的，如Williams等[10]利用RAPD標記對蠶豆的66個后代材料進行遺傳分析，其結(jié)果符合孟德爾遺傳規(guī)律。國內(nèi)外一些學者如Demeke等[11]、Del Rioa等[12]、李鳳云等[13]和李先平等[14]的研究進一步證明了RAPD標記可有效地用于馬鈴薯遺傳多樣性的研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親緣關系較近的品種很早就聚在了一起，如‘超白’和‘春薯1號’、‘大西洋’和‘東農(nóng)305’，根據(jù)對它們的系譜進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)與此結(jié)果吻合，由此也說明RAPD標記結(jié)果是可靠的。

研究表明，黑龍江省馬鈴薯栽培品種的遺傳相似性較高，遺傳基礎比較狹窄，這一結(jié)果與邸宏等[15]以及段艷鳳等[16]的研究結(jié)論一致。這是由于黑龍江省近年來審定推廣的馬鈴薯主栽品種主要來源于國外引進以及利用少數(shù)國外品種選育而成，造成了黑龍江省栽培的馬鈴薯品種整體上親緣關系較近。因此在今后的育種工作中應當加強引種和資源創(chuàng)新力度，創(chuàng)造豐富的變異材料，擴大種質(zhì)資源的遺傳背景，促進馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

[1]宗緒曉,關建平,王述民,等.中國豌豆地方品種SSR標記遺傳多樣性分析[J].作物學報,2008,34(8):1330-1338.

[2]景建洲,張勇,李東亮,等.利用RAPD分子標記分析玉米種質(zhì)遺傳多樣性[J].中國農(nóng)業(yè)通報,2006,12(12):405-408.

[3]陳兆貴,鄧漢超,趙淑平.47份水稻品種資源的ISSR遺傳多樣性分析[J].基因組學與應用生物學,2009,28(3):498-502.

[4]楊平,劉仙俊,劉新春,等.利用SRAP標記研究四川高原青稞育成品種的遺傳多樣性[J].遺傳,2008,30(1):115-122.

[5]楊先泉,張佳,劉堅,等.應用RAPD分析四川馬鈴薯地方品種與部分栽培品種間遺傳關系[J].中國農(nóng)學通報,2010,26(22): 40-44.

[6]劉福翠,譚學林,郭華春.云南省馬鈴薯品種資源的RAPD分析[J].西南農(nóng)業(yè)學報,2004,17(2):200-204.

[7]邸宏,陳伊里,盧翠華.中國馬鈴薯部分品種資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2008,39(7):1-4.

[8]Nei M,Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76:5269-5273.

[9]趙姝華,張波.RAPD標記技術的實用性及穩(wěn)定性探討[J].國外農(nóng)學-雜糧作物,1999,19(4):13-15.

[10]Williams J G K,Kubelik A R,Livak K J,et al.DNA polymorphisms amplification by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Res,1990,18:6531-6535.

[11]Demeke T,Kawchuk L M,Lynch D R.Identification of potato cultivars and clonal variants by random amplified polymorphic DNA analysis[J].Am Potato J,1993,70:561-570.

[12]Del Rioa A H,Bamberg J B,Huamanc Z,et al.Association of ecogeographical variables and RAPD marker variation in wild potato populations of the USA[J].Crop Sci,2001,41:870-878.

[13]李鳳云,盛萬民,劉昭軍,等.馬鈴薯品種遺傳多樣性的RAPD和AFLP標記分析[J].中國馬鈴薯,2007,21(5):266-271.

[14]李先平,何云昆,孫茂林,等.馬鈴薯RAPD分析方法優(yōu)化初探[J].西南農(nóng)業(yè)學報,2000,13(1):59-64.

[15]邸宏,陳伊里,金黎平,等.RAPD和AFLP標記分析中國馬鈴薯主要品種的遺傳多樣性[J].作物學報,2006,32(6):899-904.

[16]段艷鳳,劉杰,卞春松,等.中國88個馬鈴薯審定品種SSR指紋圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性分析[J].作物學報,2009,35(8): 1451-1457.

RAPD Analysis of Genetic Diversity for Leading Potato Varieties
in Heilongjiang Province

ZHAO Guanglei1,ZHANG Yakui1,WU Lingjuan1,XU Xuepu1,DIAO Zhuo1,
LI Gongyi1,LIANG Jie1,DONG Chuanmin1,WEN Fujun1,LU Wenhe2＊
(1.Daxinganling Academy of Agriculture and Forestry,Jiagedaqi,Heilongjiang 165000,China;
2.Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

The random amplified polymorphic DNA procedure(RAPD)was used to assess the genetic diversity for 34 leading potato varieties in Heilongjiang Province,which were to understand the genetic relationship of these leading potato varieties,and provide the theoretical basis for the breeding of potato varieties.The result showed that there were 135 polymorphic bands amplified with 34 primers,and the polymorphic rate was 73%;these 34 potato varieties were divided into threeclassesandsevensubclasses,andthegeneticdistanceamong34potatovarietieswasrangedfrom0.112to0.551,with an average of 0.364.These results suggest that the genetic similarity is high and the genetic base is narrow among leading potatovarietiesinHeilongjiangProvince.

potato;RAPD analysis;genetic diversity;Heilongjiang Province

S532

A

1672－3635（2014）02-0065-05

2014-03-05

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（Zhsyz-1）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（3-6-1-6）。

趙光磊（1984-），男，碩士，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究。

呂文河，教授，博士生導師，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究，E-mail:luwenhe@yahoo.com。