自體表皮細(xì)胞懸液促進(jìn)大鼠Ⅲ度燒傷創(chuàng)面愈合效果研究

趙洪良，趙連魁，楊高松，李冬軍，鄭文立，李 明

(石家莊市第一醫(yī)院燒傷整形科河北石家莊050011)

·基礎(chǔ)研究·

自體表皮細(xì)胞懸液促進(jìn)大鼠Ⅲ度燒傷創(chuàng)面愈合效果研究

趙洪良，趙連魁，楊高松，李冬軍，鄭文立，李 明

(石家莊市第一醫(yī)院燒傷整形科河北石家莊050011)

目的：探討自體表皮細(xì)胞懸液促進(jìn)Ⅲ度燒傷創(chuàng)面愈合的機(jī)制。方法：應(yīng)用切削皮法結(jié)合胰蛋白酶技術(shù)獲得自體表皮細(xì)胞懸液,皮下注射到Ⅲ度燒傷創(chuàng)面基底后觀察大鼠Ⅲ度創(chuàng)面愈合率和創(chuàng)面愈合效果。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組自體表皮細(xì)胞懸液制作整個(gè)過(guò)程約1h內(nèi)即可完成。實(shí)驗(yàn)組2和3周創(chuàng)面愈合率明顯高于對(duì)照組（＜0.01，＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組4周創(chuàng)面愈合后顏色和質(zhì)地均明顯優(yōu)于對(duì)照組（＜0.05）。結(jié)論：改進(jìn)的自體表皮細(xì)胞懸液技術(shù)可操作性強(qiáng)，具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是治療Ⅲ度燒傷創(chuàng)面的良好方法，其主要機(jī)制是表皮細(xì)胞去分化促進(jìn)皮島形成。

表皮細(xì)胞；懸液；細(xì)胞活力；三度燒傷；表皮去分化

自異體表皮移植技術(shù)成功挽救了大量燒傷及皮膚缺損患者，但是大面積深度燒傷患者的供皮區(qū)有限問(wèn)題，以及供皮區(qū)感染、瘢痕和色素異常等并發(fā)癥迫使臨床醫(yī)生不斷尋找新方法，從而能夠以較小的供皮區(qū)修復(fù)較大的創(chuàng)面，并減少供皮區(qū)并發(fā)癥。1975年培養(yǎng)自體表皮細(xì)胞獲得成功是一個(gè)重要突破，已經(jīng)在臨床得到應(yīng)用[1-5]。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的培養(yǎng)自體表皮細(xì)胞技術(shù)需要專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室，存在操作復(fù)雜和價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，并且細(xì)胞培養(yǎng)還需要有一定的時(shí)間延后，因此臨床應(yīng)用尚不滿意。而異體表皮移植，由于免疫排斥反應(yīng)存在，只能作為暫時(shí)封閉創(chuàng)面的一種方法,加上倫理問(wèn)題日漸突出導(dǎo)致異體皮來(lái)源緊張，價(jià)格不斷升高，使得其臨床應(yīng)用日益受限。值得注意的是近年來(lái)，未培養(yǎng)的自體表皮細(xì)胞懸液技術(shù)得到了快速發(fā)展，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4-9]。本研究采用改進(jìn)方法制取自體表皮細(xì)胞懸液，觀察到其促進(jìn)大鼠Ⅲ度燒傷創(chuàng)面愈合。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與燒傷模型制作：健康Wistar大鼠30只，雌雄各半，200～300g，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只。大鼠術(shù)前禁食6h，腹部皮膚消毒后，10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉。剔除背部鼠毛，在脊柱兩側(cè)各形成約3cm×3cm無(wú)毛區(qū)，用膠帶粘貼四周。無(wú)毛區(qū)暴露充分。95℃熱水直接傾倒于無(wú)毛區(qū)內(nèi)實(shí)驗(yàn)區(qū)，時(shí)間約15s，造成Ⅲ度燒傷模型。傷后10min，生理鹽水10ml腹腔注射。單籠飼養(yǎng)，每日傷口清潔消毒，每日予氨芐青霉素4萬(wàn)單位肌注。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每只大鼠背部正中線兩側(cè)形成2個(gè)創(chuàng)面分別為取皮區(qū)和實(shí)驗(yàn)區(qū)（Ⅲ度創(chuàng)面）。燒傷后第4天，全麻下行三度創(chuàng)面切痂術(shù)，直至深筋膜淺層，徹底止血后,5ml注射器經(jīng)創(chuàng)緣正常皮膚下注射自體表皮細(xì)胞懸液到創(chuàng)面基底，無(wú)菌凡士林油紗及敷料包扎[10]。

1.2 自體表皮細(xì)胞懸液的制備：大鼠背部取皮區(qū)碘伏常規(guī)消毒3次,設(shè)計(jì)切取皮片范圍1.0cm× 1.0cm，皮下注射生理鹽水使供皮區(qū)皮膚明顯腫脹并形成一個(gè)相對(duì)的平面，取無(wú)菌一次性剃須刀片,中號(hào)直血管鉗夾刀片,切下表皮，取皮片的厚度在切削時(shí)應(yīng)密切觀察?；蛘咻佪S取皮刀切取刃厚皮片，取下的皮片立即放于生理鹽水浸洗3遍備用，供皮區(qū)創(chuàng)面用無(wú)菌凡士林油紗及敷料加壓包扎。無(wú)菌條件下，將浸洗后皮片放入無(wú)菌容器中，組織剪簡(jiǎn)單剪碎皮片至直徑0.5～1.0mm大小，加入適量無(wú)菌0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液，37℃消化20min后，離心收集表皮細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞活力。觀察移植后的創(chuàng)面1周，2周，3周和4周創(chuàng)面愈合率[創(chuàng)面愈合率=(已經(jīng)愈合創(chuàng)面面積/原創(chuàng)面面積)×100%]。兩個(gè)觀察者應(yīng)用視覺(jué)評(píng)分法評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合效果包括顏色和質(zhì)地。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS16,0統(tǒng)計(jì)軟件，創(chuàng)面愈合率的比較和計(jì)數(shù)資料分析采用檢驗(yàn)。為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)菌條件下，表皮細(xì)胞懸液整個(gè)制取過(guò)程約1h，無(wú)需特殊設(shè)備。制取的自體表皮細(xì)胞懸液活細(xì)胞率均高于95%，含有表皮細(xì)胞密度為1.5～2.0×106/ml。

2.2 實(shí)驗(yàn)組移植后5～7天創(chuàng)面可見(jiàn)皮島出現(xiàn)，皮島呈離心性生長(zhǎng)，逐漸與向心性生長(zhǎng)的周邊皮膚融合。12～14天，創(chuàng)面的皮島之間及創(chuàng)緣上皮接觸，表皮細(xì)胞進(jìn)一步成熟和分化，創(chuàng)面愈合良好。19～21天表皮層逐漸增厚，有一定程度色素沉著。4周時(shí)色素沉著明顯減退，新生皮膚上皮層較厚“柔軟”、“耐摩擦”有一定彈性，外觀較接近鼠脫毛后的正常皮膚。對(duì)照組大鼠創(chuàng)面有一定程度收縮，10～14天可見(jiàn)肉芽組織形成，創(chuàng)緣上皮向心性生長(zhǎng)，有較多滲出液。18～20天創(chuàng)面愈合再上皮化，創(chuàng)面上形成薄薄的上皮，傷口表面覆蓋新鮮細(xì)嫩的表皮組織。4周新生皮膚上皮層薄，易破潰，皮膚彈性差。

2.3 創(chuàng)面愈合率(表1)實(shí)驗(yàn)組2周和3周創(chuàng)面愈合率明顯高于對(duì)照組(＜0.01)。

2.4 創(chuàng)面愈合效果(表2)。實(shí)驗(yàn)組4周創(chuàng)面愈合后顏色和質(zhì)地均明顯優(yōu)于對(duì)照組（＜0.05）。

表1 兩組創(chuàng)面愈合率的比較

表2 兩組創(chuàng)面愈合效果的比較（視覺(jué)評(píng)分法）

3 討論

自體表皮細(xì)胞懸液根據(jù)制取方法可分為未培養(yǎng)自體表皮細(xì)胞懸液和培養(yǎng)后自體表皮細(xì)胞懸液。傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室，并且培養(yǎng)細(xì)胞需要2～3周時(shí)間，因此在臨床應(yīng)用收到了較大的限制，但因?yàn)楣?jié)約供皮區(qū)的優(yōu)點(diǎn)，仍然在臨床得到應(yīng)用[4-5]。

自體表皮細(xì)胞懸液在臨床應(yīng)用目前有兩種方法：一步法和二步法[6-9]。一步法是指自體表皮細(xì)胞懸液直接應(yīng)用于經(jīng)過(guò)清創(chuàng)后相對(duì)無(wú)菌的創(chuàng)面上。二步法是指首先在清創(chuàng)后相對(duì)無(wú)菌創(chuàng)面上移植脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，待其實(shí)現(xiàn)基質(zhì)血管化后再次手術(shù)應(yīng)用自體表皮細(xì)胞懸液。本研究采用一步法，應(yīng)用自體表皮細(xì)胞懸液修復(fù)創(chuàng)面，具有操作簡(jiǎn)單，節(jié)約供皮區(qū)面積的優(yōu)點(diǎn)。

自體表皮細(xì)胞懸液在創(chuàng)面有多種應(yīng)用方法，例如刷子，注射器或者儀器噴射到創(chuàng)面均有報(bào)道，但創(chuàng)面皮下注射方法未見(jiàn)報(bào)道。前幾種方法存在自體表皮細(xì)胞懸液的無(wú)序流動(dòng)會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面應(yīng)用自體表皮細(xì)胞懸液不均勻，術(shù)后需要一定時(shí)間內(nèi)限制活動(dòng)等缺點(diǎn)。本研究采取了創(chuàng)面下注射，這與表皮細(xì)胞懸液直接應(yīng)用創(chuàng)面相比，操作方便，修復(fù)創(chuàng)面部位可自由選擇，自體表皮細(xì)胞分布均勻而且不用術(shù)后限制活動(dòng)[10]。

皮島的形成在創(chuàng)面愈合過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用，這是因?yàn)閯?chuàng)面內(nèi)皮島的數(shù)量不但直接影響創(chuàng)面愈合速度，而且對(duì)于創(chuàng)面愈合質(zhì)量也有關(guān)鍵作用。已有研究表明皮島的來(lái)源主要有：一是創(chuàng)傷后皮膚干細(xì)胞殘留；二是表皮細(xì)胞去分化為皮膚干細(xì)胞。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)是三度燒傷創(chuàng)面，創(chuàng)傷后皮膚干細(xì)胞殘留可以忽略不計(jì)。由于在皮膚損傷后成纖維細(xì)胞明顯增生會(huì)一方面導(dǎo)致膠原蛋白合成明顯增加促進(jìn)創(chuàng)面愈合，另一方面分泌大量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，已有研究表明成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能夠在體外誘導(dǎo)表皮細(xì)胞逆轉(zhuǎn)分化形成幼稚型表皮前體干細(xì)胞[11]。進(jìn)一步的研究表明，創(chuàng)面內(nèi)Wnt/β-catenin通路活化可引起人成熟表皮細(xì)胞的去分化[12]。本實(shí)驗(yàn)表明，在表皮細(xì)胞移植后形成人造皮島，從而促進(jìn)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面皮島較多的早期形成，其可能的機(jī)制為成熟表皮細(xì)胞懸液注射到創(chuàng)面下后，在創(chuàng)面內(nèi)炎癥因子及成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞因子通過(guò)旁分泌途徑的刺激下，發(fā)生去分化成為增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞，促進(jìn)形成皮島，并逐漸擴(kuò)展，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。實(shí)驗(yàn)組14天創(chuàng)面愈合率明顯高于對(duì)照組（＜0.01），這說(shuō)明應(yīng)用表皮細(xì)胞懸液可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，而且創(chuàng)面愈合后的顏色和質(zhì)地均明顯優(yōu)于對(duì)照組（＜0.05）。

綜上所述，改進(jìn)的自體表皮細(xì)胞懸液具有快速、簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是一種治療深度燒傷創(chuàng)面和皮膚缺損類(lèi)疾病的良好手段，其主要機(jī)制是表皮細(xì)胞去分化促進(jìn)皮島形成。

[1]Billingham RE,Reynolds J.Transplantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions[J].Br J PlastSurg,1952,5(1):25-36.

[2]Rheinwald JG,Green H.Serialcultivation of strains of human epidermal keratinocytes:the formation of keratinizing colonies from single cells[J].Cell,1975,6(3):331-336.

[3]Woodley DT,Peterson HD,Herzog SR,et al.Burn wounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils[J].JAMA,1988,259(17): 2566-2571.

[4]Wood FM,Kolybaba ML,Allen P.The use of cultured epithelial autograft in the treatment of major burn wounds: Eleven years of clinical experience[J].Burns,2006,32(5): 538-544.

[5]Haguen Lee.Outcomes of sprayed cultured epithelial autografts for full-thickness wounds:A single-centre experience[J].Burns,2012,38(6):931-936.

[6]Gerlach JC,Johnen C,Ottoman C,etal.Method for autologous single skin cell isolation for regenerative cell spray transplantation with non-cultured cells[J].Int J Artif Organs, 2011,34(3):271-279.

[7]Wood FM,Stoner ML,Fowler BV,et al.The use of a non-cultured autologous cell suspension and integra dermal regeneration template to repair full-thickness skin wounds in porcine model:a one-step process[J].Burns,2007,33(6): 693-700．

[8]Campanella,SD,Rapley P,Ramelet AS.A randomised controlled pilotstudy comparing Mepiteland SurfaSofton paediatric donor sites treated with Recell[J].Burns,2011, 37(8):1334-1342．

[9]吳昌炎,房志強(qiáng),江寶華,等.自體表皮細(xì)胞懸液在修復(fù)皮膚組織缺損創(chuàng)面中的作用研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2012,21 (12):2201-2203.

[10]Fredriksson C,Kratz G,Huss F.Transplantation of cultured human keratinocytes in single cellsuspension:a comparative in vitro study of different application techniques[J].Burns, 2008,34(2):212-219.

[11]孫曉艷,付小兵,伊海英,等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化的初步研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,30(21):2003-2007.

[12]張翠萍,陳鵬,付小兵,等.Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化對(duì)人表皮細(xì)胞表型變化的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,32(16):1716-1719.

Full-thickness burns of rats were healed with improved autologous epidermal cell suspension

ZHAO Hong-liang,ZHAO Lian-kui,YANG Gao-song,LIDong-jun,ZHENG Wen-li,LIMing
(Departmentof Burns and Plastic,Shijiazhuang First Hospital,050011 Shijiazhuang,Hebei,China)

Objective To investigate the mechanism of improved epidermal cell suspension to treat full-thickness degree burns.Methods Epidermal cell suspension was made with an improved method.The cure rate and quality after epidermalcellbeing injected were evaluated in rats with fullthickness degree burns.30 rats were divided into control and therapy groups.Each group includes 15 rats.Results It took one hour to acquire epidermalcellsuspension.Cure rate of therapy group at 2 and 3 weeks was significantly higher than that ofcontrolgroup（<0.01，<0.05）.The quality ofskin in therapy group was also significantly better than that of control group at 4 weeks（<0.05）. Conclusion It is a simple,easy and economical way to acquire epidermal cell suspension.Fullthickness burns of rats could be healed with it.

epidermalcell;suspension；cellviability；full-thickness degree burns;epidermaldedifferentiation

R644

A

1008-6455（2014）23-1978-03

2014-10-28

2014-12-11

編輯/張惠娟

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃20120171