HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地火麻仁藥材中胡蘆巴堿的含量*

蔡明宸，張北燦，魯雅文，夏林波，朱江，鄧仕任

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地火麻仁藥材中胡蘆巴堿的含量*

蔡明宸，張北燦，魯雅文，夏林波，朱江，鄧仕任

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的：建立高效液相色譜測(cè)定火麻仁藥材中胡蘆巴堿含量的方法，為2015版藥典火麻仁指標(biāo)性成分的含量測(cè)定項(xiàng)提供依據(jù)。方法：采用Hypersil氨基柱，流動(dòng)相乙腈-水（80∶20，V∶V），檢測(cè)波長265nm。結(jié)果：胡蘆巴堿進(jìn)樣量在0.104～1.04μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999（n=6），加樣回收率100.7%，RSD=1.56%（n=9）；10批火麻仁藥材中胡蘆巴堿的含量為0.6504～0.9931mg·g-1。結(jié)論：胡蘆巴堿為火麻仁藥材及飲片中的特征成分，其提取及含測(cè)方法操作簡便，結(jié)果可靠，可作為火麻仁藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

火麻仁；胡蘆巴堿；高效液相色譜法；中國藥典

火麻仁別名麻子、麻子仁、大麻子，為桑科植物大麻Cannabissativa L.的干燥成熟果實(shí)，臨床上主要用于腸燥便秘，血虛津虧等癥[1，2]。2010藥典中火麻仁藥材僅有性狀鑒別和薄層鑒別項(xiàng)，指標(biāo)性成分的含量測(cè)定項(xiàng)缺失，不利于藥材的質(zhì)量控制。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，火麻仁中含有胡蘆巴堿[3]，經(jīng)火麻仁醇提取物的化學(xué)成分的HPLC分析，并與胡蘆巴堿的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，最終確定胡蘆巴堿為火麻仁藥材及飲片中的主要生物堿成分。胡蘆巴堿具有抗腫瘤及降血糖的活性作用，還可以有效治療一些皮膚病[4-6]。目前，國內(nèi)外對(duì)火麻仁藥材的報(bào)道主要集中脂肪酸類、大麻酚類物質(zhì)等方面[7，8]，對(duì)火麻仁中生物堿進(jìn)行的含量測(cè)定研究甚為少見。本實(shí)驗(yàn)擬以胡蘆巴堿為指標(biāo)成分，通過對(duì)火麻仁中胡蘆巴堿的提取工藝的考察，采用氨基鍵合色譜柱為固定相，建立了火麻仁藥材中胡蘆巴堿的HPLC分析方法，以期為2015版中國藥典中火麻仁的含量測(cè)定項(xiàng)提供相關(guān)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

LC-10AT型雙泵高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-10AVP紫外檢測(cè)器；METTLERAE240型十萬分之一分析天（瑞士METTLER）；FA1004B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

胡蘆巴堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所）（833-200001）；甲醇（A.R.）；乙腈（C.P.天津市大茂化學(xué)試劑廠）；水為超純水。

1.2 色譜條件

大連伊力特Hypersil NH2色譜柱（4.6×250 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈-水（80∶20，V∶V）；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長265nm；柱溫25℃；理論塔板數(shù)按胡蘆巴堿峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

1.3 對(duì)照品溶液制備及線性關(guān)系考察

取胡蘆巴堿對(duì)照品2.60mg，精密稱定，置5mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1mL儲(chǔ)備液，置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為52μg·mL-1的對(duì)照品溶液。進(jìn)樣量依次為2、6、10、14、18、20μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得回歸方程為y=1.2×106χ+7650，胡蘆巴堿在0.104～1.04μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999，n=6）。

1.4 供試品溶液的制備

取胡蘆巴粉末（過40目篩）約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20%甲醇25mL，密塞，稱定重量，放置1h，在20℃下超聲處理10min，超聲3次，冷卻至室溫，再稱定重量，用20%甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一火麻仁藥材按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得保留時(shí)間RSD= 0.23%，峰面積RSD=1.05%，表明儀器精密度良好。

1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一火麻仁藥材按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h測(cè)定峰面積。平均峰面積為588806.5，RSD=1.304%（n=6）。表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一火麻仁樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)得樣品中胡蘆巴堿含量的平均值為1.031mg·g-1，RSD=1.055%，證明本方法重復(fù)性良好。

1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知胡蘆巴堿含量（0.9626mg·g-1）的藥材（產(chǎn)地河北）9份，每份約0.5g，精密稱量，3份為一組，置具塞錐形瓶中，每組精密加入低、中、高濃度胡蘆巴堿對(duì)照品貯備液，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果平均加樣回收率100.7%，RSD=1.56%（n= 9）。

1.9 樣品含量的測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地的火麻仁約1g，精密稱定，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，其色譜峰如圖2，記錄下峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中含有胡蘆巴堿的含量，結(jié)果見表1。

圖1 胡蘆巴堿對(duì)照品和樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC of reference substance and sample of trigonelline

表1 火麻仁中胡蘆巴堿的含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination resultof trigonelline contentof semen cannabis

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)于火麻仁藥材定義的規(guī)范

2005版藥典規(guī)定火麻仁為“桑科植物大麻……的干燥成熟果實(shí)”；而2010版藥典則為“?？浦参锎舐椤母稍锍墒旆N子”。這種情況在各版中國藥典中反復(fù)出現(xiàn)，比較混亂。顯微鑒定表明，大麻的果實(shí)是由果皮和種子兩部分組成，而種子則又由種皮和種仁兩部分組成，與文獻(xiàn)記載一致[9]。目前，記載混亂的原因可能是，火麻仁作為潤腸通便的良藥，其有效部位應(yīng)為種子中的油脂，所以描述為“種子”；然而去除果皮后的種子含油量太高（大于50%），容易酸敗變質(zhì)而不易保存，因此，該藥材在采收、加工、流通、儲(chǔ)存、銷售等環(huán)節(jié)中，均為果實(shí)的形態(tài)，故而描述為“果實(shí)”。我們對(duì)火麻仁果皮和種子的化學(xué)成分進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明二者的成分種類及含量均有著巨大的差別，因此，規(guī)范火麻仁藥材的定義尤為必要。通過對(duì)歷代本草著作的考察，我們發(fā)現(xiàn)火麻仁除了潤腸通便作用之外，還有“祛瘀”、“殺蟲”等功效，且以“果實(shí)”入藥。綜合考慮其在流通、儲(chǔ)存等過程中的可操作性，以及對(duì)目前實(shí)際藥材市場(chǎng)的可指導(dǎo)性，初步擬定火麻仁藥材為“?？浦参锎舐椤母稍锍墒旃麑?shí)”。而去除果皮的種子部分，由于油脂含量較高，藥效較好，且不含有大麻酚類毒性成分，初步將其擬定為火麻仁飲片。

2.2 胡蘆巴堿作為指標(biāo)性成分的選定原則

由于火麻仁飲片使用的是其種子部分，因此，所選取的指標(biāo)性成分必須是種子中的特征成分，而不能選取僅在果皮中存在的成分，這樣才能采用同一種指標(biāo)成分對(duì)火麻仁藥材和飲片同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制。檢測(cè)結(jié)果表明，火麻仁果皮和種子中均有的胡蘆巴堿分布，因此，采用胡蘆巴堿作為指標(biāo)成分是比較適合的。

2.3 2010藥典的檢測(cè)方法

2010藥典在測(cè)定胡蘆巴藥材中的胡蘆巴堿含量時(shí)，選用了C18反相鍵合色譜柱，考慮到反相柱的應(yīng)用較為普遍，筆者初期也采用了C18作為固定相，該方法在測(cè)定生物堿樣品時(shí)需要使用十二烷基磺酸鈉等離子對(duì)色譜模式。然而，實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，離子對(duì)色譜存在以下不足：體系平衡時(shí)間較長（約需平衡3h）；色譜峰分離度的重現(xiàn)性不佳；保留時(shí)間漂移較大；鹽濃度較高，對(duì)色譜柱和色譜儀的壽命影響較大，因此，改用了氨基鍵合硅膠作為固定相。經(jīng)3根不同品牌氨基柱在3臺(tái)不同品牌色譜儀上進(jìn)行考察，結(jié)果表明，當(dāng)氨基柱柱效不低于10000時(shí)，能得到峰型對(duì)稱、出峰時(shí)間適中、保留時(shí)間穩(wěn)定、分離度高的色譜圖，因此，最終選定了氨基鍵合硅膠作為固定相。

2.4 胡蘆巴堿的提取

胡蘆巴堿是一種極性化合物，以內(nèi)鹽形式存在，易溶于水，甲醇，乙醇等極性溶劑，不溶于乙醚，氯仿等低極性溶劑，文獻(xiàn)在提取方法上多采用超聲提取法[10-12]。本文選擇不同比例的甲醇-水對(duì)采用超聲法對(duì)其提取，通過單因素考察及正交試驗(yàn)表明，胡蘆巴堿的最優(yōu)提取工藝為：甲醇濃度為20%，料液比為1∶25，提取時(shí)間為10min，溫度為20℃，超聲提取3次。

3 結(jié)論

本文對(duì)10批不同產(chǎn)地的火麻仁藥材中葫蘆巴堿進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果分布在0.6504～0.9931 mg·g-1范圍內(nèi)，初步擬定火麻仁藥材中葫蘆巴堿含量不得低于0.65‰。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010，74．

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986，498.

［3］中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志（第3冊(cè)）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1984.266.

［4］荊宇,趙余慶.胡蘆巴化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2003，34（12）：1146-1149.

［5］朱寶立,班永宏,段金廒.胡蘆巴對(duì)急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2000，13（1）：19-21．

［6］姜華,尹湉,趙余慶.胡蘆巴堿的生物分布與藥理作用［J］.中草藥，2008，39（4）：附2-附4.

［7］夏林波,郭瑩,鄧仕任.硅膠柱層析-RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定火麻仁中3種大麻酚類化合物的含量［J］.中國藥房，2011，22（27）：2557-2560.

［8］夏林波,鄧仕任,郭瑩.HPLC法測(cè)定火麻仁中α-亞麻酸的含量［J］.化學(xué)工程師，2011，17（3）：17.

［9］郝虹,李偉廣,李書淵.火麻仁的生藥學(xué)研究［J］.中國醫(yī)藥指南，2012，10（27）：83.

［10］劉廣學(xué),尚明英,李輝,等.胡蘆巴藥材中胡蘆巴堿的提取方法及其含量測(cè)定［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：11-14.

［11］徐雅琴,劉春生,崔崇士.超聲法提取南瓜果肉中胡蘆巴堿最佳提取工藝的研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，（10）：7-13.

［12］劉衡,徐春芬,陳英.HPLC法測(cè)定不同種天南星中胡蘆巴堿的含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4（18）：177-178.

Determ ination of trigonelline in fruit of Cannabis sativa from different origin by HPLC*

CAIMing-chen，ZHANG Bei-can，LU Ya-wen，XIA Lin-bo，ZHIJiang，DENG Shi-ren
（College ofMedicine,Liaoning Uniuersity of Traditional Cheinese Medicine,Dalian 116600,China）

Objective:An HPLCmethod for determination of trigonelline in fruit of Cannabis sativa was developed,to provide a quality controlmethod for 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia.Methods:The chromatography was carried outon a Hypersil amino column（250mm×4.6mm,5μm）with acetonitrile-water（80:20,V∶V）as themobile phase,the detection wavelength was set at 265nm.Results:Trigonelline could be successfully determ ined and the linear rang was 0.104～1.04μg（r=0.9999）.The average recoveries（n=9）of the trigonelline was 100.7%，RSD=1.56%.The content of trigonelline in 10 batches was 0.6504～0.9931mg·g-1.Conclusion: Trigonelline was indeed the specific ingredient in fruit and seed of Cannabis sativa.The method is accurate,reliable and sensitive for quality control of fruitof cannabis sativa.

Cannabis semen;trigonelline;HPLC;Chinese Pharmacopoeia

O657.7

A

1002-1124（2014）07-0029-03

2014-03-26

2015年版中國藥典一部科研立項(xiàng)（火麻仁及飲片）；2013年遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310162013）

蔡明宸（1989-），女，碩士研究生，研究方向：中藥炮制。

鄧仕任（1979-），博士，副教授。