HPLC法測(cè)定L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中L-丙氨酸含量

袁慰，王永秋

（淮北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽淮北235000）

分析測(cè)試

HPLC法測(cè)定L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中L-丙氨酸含量

袁慰，王永秋*

（淮北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽淮北235000）

建立了HPLC法分離測(cè)定L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中L-丙氨酸含量。色譜條件為：Shim-packVP-ODS柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-NaH2PO4水溶液，NaH2PO4溶液濃度為0.05mol·L-1、pH值為6.50（H3PO4調(diào)節(jié)），甲醇與NaH2PO4溶液體積比為1∶9；流速0.80mL·min-1；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；進(jìn)樣量5μL。該方法的建立為L(zhǎng)-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的測(cè)定提供了新方法。

HPLC；L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽；L-丙氨酸

以氨基酸為原料合成的氨基酸甲酯鹽酸鹽在藥物化學(xué)、生物合成化學(xué)、食品加工和光學(xué)活性材料等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1-4]。氨基酸甲酯鹽酸鹽不但有較強(qiáng)的吸水性,而且穩(wěn)定性較高，干燥后可保存?zhèn)溆?，十分方便[5]。目前，有關(guān)氨基酸衍生物測(cè)定的方法正在不斷發(fā)展，色譜法、電化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法是常用的方法，但采用液相色譜檢測(cè)L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽及L-丙氨酸的方法未見(jiàn)報(bào)道。本文建立的高效液相色譜測(cè)定方法，為生產(chǎn)和使用該產(chǎn)品的企業(yè)提供一種檢測(cè)手段。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

L-丙氨酸，L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，NaH2PO4，KH2PO4均為分析純，甲醇為色譜純，超純水。

島津LC-20A高效液相色譜儀；島津SPD-M20A二極管陣列紫外檢測(cè)器；島津LC-Solution色譜工作站；Mole超純制水機(jī)（上海摩勒生物科技公司）；pHS-3C酸度計(jì)（上海雷磁）。

1.2 溶液配制

精密稱取一定量L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽，分別用流動(dòng)相溶解，并定容到100.0mL。將L-丙氨酸再分別稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3 色譜條件

Shim-pack VP-ODS柱（150mm×4.6mm I.D, 5μm）；流動(dòng)相為甲醇-Na2HPO4水溶液，甲醇與Na2HPO4溶液體積比為1∶9，Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1、pH值為6.50（用H3PO4調(diào)節(jié)）；流速為0.80mL·min-1；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；進(jìn)樣量為5μL。

2結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相的選擇采用Shim-pack VP-ODS柱，用甲醇-KH2PO4混合水溶液做流動(dòng)相。分別考察了甲醇與KH2PO4溶液體積比、KH2PO4溶液濃度、pH值對(duì)L-丙氨酸和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽分離的影響，結(jié)果表明L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽與L-丙氨酸均不能實(shí)現(xiàn)基線分離。

當(dāng)用甲醇-Na2HPO4混合水溶液為流動(dòng)相時(shí)，L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-丙氨酸的分離度明顯增加。當(dāng)Na2HPO4溶液的濃度由0.01mol·L-1增加到0.05mol·L-1時(shí)，分離度增加，繼續(xù)增加磷酸鹽溶液濃度至0.1mol·L-1，發(fā)現(xiàn)兩者的分離度又變小。

在Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1（pH值8.40）不變的前提下，用H3PO4調(diào)節(jié)其pH值，降低磷酸鹽溶液的pH值，分離度有所增加，但pH值低于6.5時(shí)，分離度變小。

在Na2HPO4溶液濃度為0.05%mol·L-1，pH值6.5不變的前提下，調(diào)節(jié)甲醇與Na2HPO4溶液的體積比，由3∶7到2∶8到1∶9，發(fā)現(xiàn)兩者體積比減小，分離度增加。

故選用Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1，pH值6.5（H3PO4調(diào)節(jié)），甲醇與Na2HPO4溶液體積比為1∶9，作為本研究的最佳流動(dòng)相參數(shù)。

2.1.2 流速和柱溫的選擇按照上述確定的流動(dòng)相參數(shù)，改變流速（從0.2到1.0mL·min-1）時(shí)，發(fā)現(xiàn)流速越小，分離效果越好，但是相應(yīng)的分析時(shí)間也會(huì)變長(zhǎng)，流速為0.8mL·min-1時(shí)可達(dá)到基線分離。當(dāng)改變柱溫時(shí)發(fā)現(xiàn)，將柱溫升高會(huì)導(dǎo)致基線不穩(wěn)，以30℃較好。

綜上所述，色譜條件可確定為：Shim-pack VP-ODS柱（150mm×4.6mm I.D,5μm）；流動(dòng)相為甲醇-Na2HPO4混合水溶液，Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1、pH值6.5.00（H3PO4調(diào)節(jié)），甲醇與Na2HPO4液體積比為1∶9；流速為0.80mL·min-1；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；進(jìn)樣量5μL。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽色譜圖Fig.1The HPLC Chromatograms of L-alanine methyl ester hydrochloride

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

選取5個(gè)適宜濃度的L-丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，按照上述確定的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣前用0.45 μm膜過(guò)濾，按峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性擬合，得到L-丙氨酸的線性回歸方程。結(jié)果表明，L-丙氨酸在1.01～5.05g·L-1濃度范圍內(nèi)有較好線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=203193X-5466，相關(guān)系數(shù)為0.9998。L-丙氨酸檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.00588和0.0196g·L-1。

2.3 方法的精密度

將L-丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液分別放置0、1、2、3、4、5h以及0、1、2、3、4、5d，經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾后，按上述確定色譜條件進(jìn)樣，記錄色圖譜數(shù)據(jù)，按面積-外標(biāo)法計(jì)算日內(nèi)、日間的RSD，分別為0.77%和1.9%，表明實(shí)驗(yàn)精密度較好，誤差較小，穩(wěn)定性較好。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性

2.4.1 回收率的測(cè)定稱取一定量L-丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，加到L-丙氨酸甲酯混合液中，0.45μm膜過(guò)濾，按上述確定的色譜條件進(jìn)樣，平行測(cè)定9次，記錄數(shù)據(jù)，按照峰面積-外標(biāo)法計(jì)算含量和回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率的測(cè)定結(jié)果Tab.1The Results of the recovery

由表1可知，平均回收率和RSD均符合正常測(cè)定要求，該方法的準(zhǔn)確度較高。

2.4.2 重復(fù)性的測(cè)定稱量同一批次的L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽樣品6份，每份100.0 mg，用100.0mL流動(dòng)相溶解，得到樣品溶液，用0.45μm膜過(guò)濾后，按上述確定色譜條件進(jìn)樣5μL，記錄數(shù)據(jù)，按照峰面積-外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性的測(cè)定結(jié)果Tab.2The Results of the repetition

由表2可知，RSD為1.97%，說(shuō)明利用HPLC測(cè)量L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中L-丙氨酸含量重復(fù)性較好，試驗(yàn)方法可靠，符合正常檢測(cè)要求。

3結(jié)論

本方法精密度和準(zhǔn)確度較高，線性關(guān)系良好，且均達(dá)到要求，可以定量檢測(cè)L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中的L-丙氨酸雜質(zhì)，為生產(chǎn)和使用L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的企業(yè)提供一種檢測(cè)手段。

［1］劉蕾,趙瑾,王超杰,等.N-茄呢基谷氨酰胺類化合物的合成［J］.化學(xué)研究,2004,15（3）:27-29.

［2］YAYLAYAN V A,KEYHANI A.Carbohydrate and aminoacid degration pathways in L-metionine/D-［13C］glucose model systems［J］.J.Agric.Food Chem.,2001,49（2）:800-803.

［3］NAGAI A,MIYAGAWA T,KUDO H,et al.Controlled cationic ring-opening olymerization of 1,3-oxazolidine-2-thione derived fromL-serine［J］.Mac romolecules,2003,26 25）:9335-9339.

［4］LALLMS,RAMTOHULYK,JAMESMNG,et al.Serine and threonine β-lactones:a newclass of hepatitis a virus 3c cysteine proteinase inhibitors［J］.J.Org.Chem，2002,67（5）:1536-1547.

［5］曾向潮,徐石海,李毅,等.N-（2-吡咯甲?；┌被峒柞サ暮铣桑跩］.有機(jī)化學(xué),2004,24（7）:802-805.

Determination of L-alanine in L-alanine methyl ester hydrochloride by HPLC

YUAN Wei，WANG Yong-qiu*
（Department of Chemistry and Materials Science,Huaibei Normal University,Huaibei 235000,China）

A method for determining the L-alanine in L-alanine methyl ester hydrochloride by HPLC was established.The chromatography separation was performed on an VP-ODS（150mm×4.6 mm,5μm）；Mobile phase: methanol and disodium hydrogen phosphate aqueous;the concentration of disodium hydrogen phosphate is 0.05 mol·L-1,pH=6.50;methanol:disodium hydrogen phosphate=1∶9;the flow rate is 0.80mL·min-1；column temperature is 30℃;the detection wavelength is 210 nm;the injection volume is 5μL.The establishment of this method for producing L-alanine methyl ester hydrochloride provides a new method for the determination of analysis.

HPLC；L-alanine methyl ester hydrochloride；L-alanine

O657.7

A

1002-1124（2014）02-0017-02

2013-12-10

袁慰（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：氨基酸酯的合成與檢測(cè)。

導(dǎo)師簡(jiǎn)介：王永秋（1962-），男，研究方向：化學(xué)應(yīng)用技術(shù)開(kāi)發(fā)。