維吾爾族飼鴿者肺患者細(xì)胞因子水平變化及臨床意義研究

王文藝,鄔 超,楊曉紅

飼鴿者肺(PBL)屬外源性過敏性肺泡炎(EAA)或過敏性肺炎(HP)，是敏感個體反復(fù)吸入鴿子的排泄物后遠(yuǎn)端支氣管及肺泡發(fā)生超敏反應(yīng)引起的肺部疾病[1-2]。PBL發(fā)病機(jī)制是以Ⅲ型免疫復(fù)合物及IV型細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[3]。本研究旨在探討維吾爾族人群中飼鴿與未飼鴿者肺泡灌洗液(BALF)與血清中IL-2、IL-10、TNF-α水平的變化及其在PBL發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年8月—2013年12月在新疆(喀什、和田)地區(qū)至少飼鴿1年以上的維吾爾族受試者，其中新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科確診為PBL的受試者65例為病例組，年齡38～78歲，平均(55.0±10.2)歲；未患PBL的受試者120例為陰性對照組，年齡35～75歲，平均(58.8±15.5)歲。選擇同期本院喀什、和田體檢中心體檢健康的未飼鴿的維吾爾族受試者120例為正常對照組，年齡39～76歲，平均(46.5±11.8)歲。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 病例組：符合PBL診斷標(biāo)準(zhǔn)并確診為PBL的維吾爾族受試者。PBL的診斷主要參考過敏性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即Lacasse等[4]提出的標(biāo)準(zhǔn)。陰性對照組：至少飼鴿1年以上且未患PBL的維吾爾族受試者。正常對照組：醫(yī)學(xué)確診無其他疾病的健康維吾爾族體檢者。病例組與陰性對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：特發(fā)性間質(zhì)性肺炎、慢性支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺炎，風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤性疾病等；其他過敏性疾病及其他肺彌漫性病變疾病；飼鴿<1年及飼養(yǎng)其他禽類者。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 標(biāo)本制備 3組受試者均晨起抽取空腹靜脈血4 ml，于3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑中3 500 r/min(離心半徑13.5 cm)離心5 min，分離血漿及血細(xì)胞，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。BALF使用雙層無菌紗布過濾，將無用黏液及痰液過濾掉后，所剩液體立即裝入硅塑瓶，以3 000 r/min(離心半徑為10 cm)離心10 min后留取上清液，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細(xì)胞因子水平 采用ELISA檢測BALF與血清中IL-2、IL-10、TNF-α的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作(ELISA試劑盒購于蘇州卡爾文生物科技有限公司，均由英國Costar公司生產(chǎn))，在96孔ELISA平板各孔中加100 μl按一定比例稀釋的包被抗體，4 ℃孵育過夜，經(jīng)清洗、封閉后，在各孔中加入50 μl用0.5%BSA/PBST按一定比例稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品液或血清樣本液，在室溫下孵育60 min；每孔加入100 μl用BSA/PBST稀釋的生物素化小鼠抗細(xì)胞因子抗體，在室溫下孵育60 min；每孔加入100 μl 用BSA/PBST按1/1 000稀釋的結(jié)合辣根過氧化物酶的親和素稀釋液，在室溫下孵育30 min；最后在每個孔中加入100 μl 底物溶液,黑暗中室溫下孵育30 min，再加入12.5%的H2SO4終止反應(yīng)。將標(biāo)準(zhǔn)品的測試結(jié)果繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，在分光光度計490 nm波長處讀取光密度值，根據(jù)樣品的測定結(jié)果計算出IL-2、IL-10、TNF-α的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 3組受試者的性別構(gòu)成和年齡間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2 BALF與血清中細(xì)胞因子水平比較

2.2.1 BALF與血清中IL-2、TNF-α表達(dá)水平比較 病例組BALF與血清中IL-2、TNF-α的表達(dá)水平均較陰性對照組、正常對照組升高，陰性對照組較正常對照組亦升高(P<0.05，見表2、3)。

2.2.2 BALF與血清中IL-10表達(dá)水平比較 病例組、陰性對照組BALF、血清中IL-10的表達(dá)水平較正常對照組降低(P<0.05)；而病例組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2、3)。

表1 3組受試者性別和年齡比較Table 1 Comparison of sex and age in three groups

注：*為F值

表2 3組受試者BALF中IL-2、IL-10、TNF-α水平比較Table 2 Comparison of IL-2,IL-10,TNF-α levels in BALF in three groups

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，△P<0.05

表3 3組受試者血清中IL-2、IL-10、TNF-α水平比較Table 3 Comparison of IL-2,IL-10,TNF-α levels in BALF in serum in three groups

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，△P<0.05

3 討論

3.1 PBL發(fā)病機(jī)制 EAA是反復(fù)吸入某些具有抗原性的有機(jī)粉塵后引起的與免疫反應(yīng)有關(guān)的肺部炎性疾病，亦稱HP。目前研究表明引起EAA的常見原因有農(nóng)民肺、甘蔗肺、蘑菇肺、空調(diào)肺、軟木塵肺、飼鳥和鴿者肺、溫室肺、麥芽、乳酪肺、垂體粉吸入肺、二異氫酸肺等[5]。盡管暴露于抗原的人數(shù)較多,但發(fā)病者占5%～15%[6]，可能與外源性抗原和自身遺傳易患性相互作用有關(guān)。

3.2 IL-2水平與PBL 近年研究認(rèn)為細(xì)胞因子可能影響支氣管哮喘和過敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展[7]。IL-2能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞分泌抗體，增進(jìn)T細(xì)胞的殺傷作用，加強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞活性[8]。研究發(fā)現(xiàn)IL-2在維持調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能方面具有重要作用[9]，已經(jīng)引起研究者的重視，成建華等[10]研究發(fā)現(xiàn)IL-2在PBL患者血清中的水平升高。本研究結(jié)果顯示，飼鴿者較未飼鴿者BALF、血清中IL-2表達(dá)水平增高，說明IL-2的表達(dá)水平在維吾爾族PBL的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可能與IL-2基因轉(zhuǎn)錄水平的變化影響體內(nèi)蛋白水平的表達(dá)有關(guān)，也可能由于長期反復(fù)吸入外界抗原(鴿子的分泌物、羽毛及排泄物)，刺激外周血淋巴細(xì)胞重新分布于肺臟，促進(jìn)局部T淋巴細(xì)胞在肺部聚集增殖，使得肺臟淋巴細(xì)胞增多，局部免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向以T細(xì)胞為主的肺泡炎。IL-2可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在單核細(xì)胞作用下，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1α被激活，幼稚巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多核巨細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞，形成肉芽腫，增加飼鴿者患PBL的風(fēng)險。

3.3 TNF-α水平與PBL TNF-α是肺部重要的炎性遞質(zhì)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化和局部浸潤，可啟動炎性反應(yīng)，正常情況下以較低水平存在于人體，過量的TNF-α可引起炎性反應(yīng)致組織器官損害[11]，促進(jìn)淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化介導(dǎo)炎性反應(yīng)的病理生理過程；有文獻(xiàn)報道顯示TNF-α的高表達(dá)與中性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞相互作用有關(guān)[12]，導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，TNF-α高表達(dá)促進(jìn)肺癌、食管癌、鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[13]。成建華等[10]研究顯示TNF-α的水平與個體所攜帶的基因型有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)PBL患者中BALF、血清中TNF-α的表達(dá)水平升高。本研究結(jié)果顯示，在維吾爾族人群中，病例組及陰性對照組TNF-α的表達(dá)水平高于正常對照組，說明在維吾爾族人群PBL發(fā)病機(jī)制中TNF-α的表達(dá)水平發(fā)揮作用，其作用機(jī)制可能是TNF-α促進(jìn)中性粒細(xì)胞表面細(xì)胞間黏附分子CD11/18表達(dá)及氧自由基釋放，介導(dǎo)粒細(xì)胞在心肺循環(huán)中黏附于肺內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮上，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮引起HP。

3.4 IL-10水平與PBL IL-10是一類具有抗炎和抗過敏作用的細(xì)胞因子，是Th2細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，可抑制Th1細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[14]，抑制單核巨噬細(xì)胞的增殖和分化，其相對或絕對分泌不足,可能是過敏性疾病的一個易感或易加重因素[15]。本研究結(jié)果顯示，IL-10的表達(dá)水平在維吾爾族PBL患者中降低，可能與新疆的地域特點、維吾爾族人群的體質(zhì)以及維吾爾族飼鴿者對該病不重視、本研究樣本量少及實驗誤差等因素有關(guān)，需要加大樣本量進(jìn)一步證實。

綜上所述，本研究通過探討B(tài)ALF、血清中IL-2、IL-10、TNF-α表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示IL-2、TNF-α的表達(dá)水平升高，參與了維吾爾族PBL的發(fā)生發(fā)展，可能影響了PBL的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸，而IL-10表達(dá)水平的降低對PBL的發(fā)生具有一定的警示作用。亟待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，研究各細(xì)胞因子的基因單核苷酸多態(tài)性與PBL的易患性，深入了解PBL發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，為其診斷及預(yù)防提供分子靶標(biāo)。

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