幾種肝郁動物造模方法比較及鼠籠加報紙固定束縛法的效果觀察?

黃 聰，倪祥惠，曹 峰，趙 博，張小容，葉金竹，吳大梅，吳 菁

(貴陽中醫(yī)學院, 貴陽 550002)

早期中醫(yī)界并沒有肝郁證動物模型，由于肝郁證常常表現(xiàn)出精神抑郁、煩躁易怒等情志改變，類似現(xiàn)代醫(yī)學的抑郁癥，故中醫(yī)學界常常借用現(xiàn)代醫(yī)學之抑郁癥動物模型研究肝郁證。

結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學的抑郁癥動物模型，中醫(yī)學界又創(chuàng)造出具有中醫(yī)特色的肝郁證動物模型的制作方法，研究這些方法大概可分為兩大類：一是應用藥物造成急、慢性中毒損傷等復制模型，如艾葉注射法[1]、CCl4注射法[2]、腎上腺素注射法[3]等；二是情志刺激造模法，如頸部帶枷單籠喂養(yǎng)法[4]、夾尾激怒打斗法[5]、束縛法(改良)[6]、捆綁法[7]、慢性輕度不可預見性應激(CUMS)造模法[8]以及居住者-入侵者(resident-intruder paradigm)造模法[9]。根據(jù)課題的需要，我們選擇了情志刺激造模方法，在實驗過程中比較了頸部帶枷單籠喂養(yǎng)法、夾尾激怒打斗法、束縛法(改良)、捆綁法、慢性輕度不可預見性應激(CUMS)造模法以及居住者-入侵者造模法，發(fā)現(xiàn)這些造模方法存在各自的優(yōu)缺點，現(xiàn)將使用體會報告如下。

1 常見非藥物造模法使用體會

1.1 頸部帶枷單籠喂養(yǎng)法

頸部帶枷單籠喂養(yǎng)法是一個較經(jīng)典的方法，在實驗過程中較難以控制的是模具頸部孔洞的大小，孔洞稍大大鼠即可在前肢協(xié)助下脫離模具，而孔洞稍小即會因動物頻繁抵抗試圖脫離枷具而出現(xiàn)頭頸部皮膚損傷。

1.2 夾尾激怒打斗法

作為經(jīng)典造模方法的夾尾激怒打斗法，在實驗過程中，夾尾大鼠常會出現(xiàn)攻擊其余大鼠的現(xiàn)象，容易操作，易達到實驗目的，但是在實驗中常出現(xiàn)大鼠軀體損傷現(xiàn)象。

1.3 束縛法(改良)

束縛法以及改良束縛法的操作方法較多，有專門的束縛籠、T型束縛架、鋼制束縛筒等，其操作簡單，易達到實驗目的。使用中發(fā)現(xiàn)，專門的束縛籠、鋼制束縛筒經(jīng)常因不能很好地適應大鼠體型，造模過程中大鼠有著較大的活動空間。

1.4 捆綁法

捆綁法可以視為一種較特殊的束縛法，就是使用繃帶束縛大鼠肢體限制活動的造模方法，是一種使動物產(chǎn)生“郁怒”從而導致“肝郁證”動物模型的特殊方法。這種方法看似簡單，但是在具體操作過程中發(fā)現(xiàn)該方法實現(xiàn)常有如下困難：①用繃帶固定，大鼠大多會將繃帶咬斷；②用繃帶捆綁大鼠肢體，如果太緊就會出現(xiàn)大鼠肢端血液回流障礙，出現(xiàn)肢端水腫，過度緊時間長還會出現(xiàn)肢端壞死；如果稍松則很難將大鼠固定住，大鼠很容易掙脫，前肢尤其容易掙脫。

1.5 慢性輕度不可預見性應激造模法(CUMS模型)

慢性輕度不可預見性應激造模法是目前現(xiàn)代醫(yī)學常用的制作抑郁癥的經(jīng)典方法，一般3周即可完成造模，是由CMS模型(chronic mild stress)減輕刺激強度、延長持續(xù)時間演變而來。操作過程中，操作相對容易，但是操作流程相對復雜，且存在刺激強度不好把握的情況，如無規(guī)則搖晃、如何把握其強度等問題。但是總體而言，該造模法是信度、效度較好的方法。

1.6 居住者-入侵者造模法

居住者-入侵者造模法是近年出現(xiàn)的抑郁證造模方法，也是利用動物之間爭斗導致動物情志異常的造模方法，該方法相對容易操作，但常有不同種或者不同窩雄性動物之間相安無事的情況出現(xiàn)，導致動物造模失敗。

2 自創(chuàng)鼠籠加報紙固定束縛法

在實驗過程中，我們利用大鼠鉆洞的習性，自創(chuàng)鼠籠加報紙固定束縛法束縛大鼠，使用普通大鼠鼠籠操作，簡單方便，其具體方法如下：利用大鼠鉆洞的習性，使大鼠鉆入鼠籠，如大鼠不鉆可輕拉鼠尾，大鼠即會自動鉆入位于頭前部的鼠籠，然后用報紙?zhí)钊笫蠛竺娴氖蠡\空間(也可使用其他紙張，一般報紙既柔軟又有一定強度)，注意報紙要往鼠籠邊的方向上塞緊，以防松動。放置大鼠時，要讓大鼠四肢在上，束縛期間可以通過觀察大鼠能否自行翻轉(zhuǎn)判斷束縛是否松動。

依據(jù)湖南陳澤奇等[10]將30名肝氣郁結(jié)病人(應用湖南醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合研究所經(jīng)鑒定的標準診斷)，以精神情志變化為特征分為偏煩躁型、偏抑郁型和中間型(即抑郁、煩躁并見或交替出現(xiàn)者)，測定病人血漿中去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(E)的含量，發(fā)現(xiàn)平均NE、 E含量與健康人相近，相同分型不同病種間NE、E含量相近，但是偏煩躁型病人的NE、E含量顯著高于偏抑郁型和中間型病人，偏抑郁型病人的NE、E含量顯著低于中間型病人及健康人對照組。這一點與抑郁癥和躁狂癥中樞神經(jīng)遞質(zhì)的變化相仿佛(有研究表明，在抑郁或躁狂時中樞5-HT含量均低下，在抑郁時中樞NE缺乏或相對缺乏，躁狂時中樞NE過多)。借鑒目前抑郁大鼠常用的檢測神經(jīng)遞質(zhì)以判斷抑郁模型成功與否的方法，課題組對比觀察了使用鼠籠加報紙固定束縛法與慢性輕度不可預見性應激造模法造模情況，比較了2種造模方法造模第1、2、3周模型大鼠體質(zhì)量變化值以及第21天大腦海馬、額葉中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE含量的變化，發(fā)現(xiàn)兩者之間在體質(zhì)量上差異有統(tǒng)計學意義，而神經(jīng)遞質(zhì)比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.1 材料與方法

2.1.1 實驗動物及分組 健康SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量150～200 g，來自第三軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心(許可證號SCXK(渝)2012-0005)，隨機分為2組并編號各20只，每5只1籠。

2.1.2 試劑 大鼠腦遞質(zhì)多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海雅吉公司，系分裝美國R&D 公司產(chǎn)品。

2.1.3 造模方法 2組動物分為束縛組和慢性輕度不可預見性應激(CUMS模型)造模組。動物適應性喂養(yǎng)1周后，束縛組每天使用鼠籠加報紙固定束縛法束縛2 h。慢性輕度不可預見性應激(CUMS模型)造模組每天隨機使用束縛2 h、無規(guī)則搖晃45 min、45℃熱刺激5 min、4℃冷水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、禁食24 h、禁水加空瓶刺激12 h、濕籠24 h這8種刺激中1～2種。造模過程中有3只動物死亡。

2.1.4 動物及標本處理 觀察動物反應，第21天處理動物。所有動物均按30 mg/kg體質(zhì)量用3%戊巴比妥鈉麻醉后斷頭，冰上取海馬以及額葉組織，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

標本稱重后，按1∶10(w∶v)加入0℃磷酸緩沖液(PBS)，使用勻漿器勻漿后，12000 r/min4℃離心15～20 min后取上清，分別按照試劑盒要求檢測大鼠額葉、海馬多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)含量。

2.2 結(jié)果

表1顯示，所有動物均于造模前、第1、2 周及處死前稱重，每組體質(zhì)量變化值以及神經(jīng)遞質(zhì)含量均符合正態(tài)分布。2組動物中，單純束縛組體質(zhì)量均較CUMS模型組增多，且同一時間段體質(zhì)量變化值比較除第2周沒有差異外，其余時間段比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 模型動物不同時間段體質(zhì)量變化值比較

注：與相應束縛組比較：**P<0.01

表2顯示，盡管2組動物在同一時間段體質(zhì)量變化差異有統(tǒng)計學意義，但是在第21天時大腦額

葉、海馬中神經(jīng)遞質(zhì)的含量沒有差異。

表2 模型動物第21天時海馬、額葉DA、NE、5-HT值比較

2.3 討論

慢性輕度不可預見性應激造模法(CUMS模型)是信度、效度較好的經(jīng)典抑郁癥造模方法，中醫(yī)學也常借用來制作肝郁(脾虛)證動物模型。通過以上研究表明，應用慢性輕度不可預見性應激造模法制作的肝郁證模型動物存在著體質(zhì)量顯著減輕的情況，這表明動物在造模期間機體消耗較多或合并有合成代謝較差。

體質(zhì)量的減輕并不作為肝郁證的臨床表現(xiàn)特征。國內(nèi)外的一些流行病學調(diào)查及臨床報道也表明，許多慢性疲勞患者在發(fā)病前曾有過長期精神緊張、不愉快的生活事件及生活習慣的改變等(也即與心理、社會等應激因素有關(guān))，發(fā)病后常伴有精神抑郁或急躁易怒、健忘等精神神經(jīng)癥狀、認知行為的改變及免疫功能紊亂等，臨床中肝郁證病人可以出現(xiàn)體質(zhì)量減輕的情況，但其減輕是肝郁的必然結(jié)果還是或然癥？肝郁證與體質(zhì)量減輕之間有否因果關(guān)系？如有什么樣的因果關(guān)系還有待探討。

綜上所述，作為制造肝郁證動物模型的慢性輕度不可預見性應激造模法，是否能夠準確地反映肝郁證值得進一步商榷。本課題組采用的鼠籠加報紙固定束縛法對體質(zhì)量的影響遠較慢性輕度不可預見性應激造模法要輕，大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化在造模第3周時沒有差異，且不需要特殊設(shè)備，操作簡便易行，可以作為一種備選的肝郁證造模方法。

[1] 鄒移海,黃韌,連志誠,等.實驗動物學[M].廣州：暨南大學出版社,1999:167-180.

[2] 須惠仁,張問渠.肝郁脾虛的理論與實驗研究[J].湖南醫(yī)學院學報,1979,4(3):131.

[3] 肖純,黃桂林,劉小剛,等.證、病結(jié)合的子宮內(nèi)膜異位癥動物模型的復制[J].中國實驗動物學雜志,2002,12(3):157.

[4] 陳小野.實用中醫(yī)證候動物模型學[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學、北京醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1993:264.

[5] 須惠仁.肝郁證的動物實驗研究——激怒刺激對大鼠血液流變學的影響[J].中醫(yī)雜志,1991,32(6):44.

[6] 陳禹,謝鳴,李艷彥,等.束縛法復制大鼠肝郁證模型的實驗研究[J].中國科技論文在線，2006-06-23,http://www.paper.edu.cn/index.php/default/releasepaper/comtene/200606-413.

[7] 喬明琦,張惠云,陳雨振,等.肝郁證動物模型研究的理論思考[J].中國醫(yī)藥學報,1997,12(5):42-44.

[8] Willner P,Towell A,Sampson D,et al.Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable mild stress and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacolgy(Berl),1987,93:358-364.

[9] 喬明琦,張惠云,魏盛,等.慢性束縛應激及居住入侵法制備經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型的行為學觀察與分析[C].第二屆“情緒與健康和疾病及其中醫(yī)藥干預”國際學術(shù)研討會暨全國第四屆中醫(yī)基礎(chǔ)理論學術(shù)年會,2010:229-235.

[10] 陳澤奇，金益強，陳國林，等.肝氣郁結(jié)證血漿去甲腎上腺素和腎上腺素測定結(jié)果分析[J].中醫(yī)藥學報，1997(5)：47-48.