基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-pel重組果膠酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)

徐 偉，姚曉靜，付大偉

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-pel重組果膠酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)

徐 偉，姚曉靜，付大偉

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

采用超聲波破碎法、鎳離子親合層析柱法，純化重組菌Escherichia coli BL21/pET-pel表達(dá)的胞內(nèi)重組果膠酶，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide pelelectrophoresis，SDSPAGE）檢測，研究純化的重組果膠酶酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：重組果膠酶純化倍數(shù)為1.71，回收率為88.5%，分子質(zhì)量約為44 kD。最適pH值為9.0～9.5，在pH 7.0～10.0之間催化性質(zhì)較穩(wěn)定；最適作用溫度范圍為45～55 ℃，在60 ℃下保溫30 min還剩余40%的酶活力；在離子濃度為1 mmol/L時，Ca2+和Co2+對該酶有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而Fe2+則對其有較強(qiáng)的抑制作用。

重組果膠酶；胞內(nèi)酶；鎳離子親合層析；酶學(xué)性質(zhì)

果膠酶是一類能夠催化果膠質(zhì)降解的復(fù)合酶。酸性果膠酶應(yīng)用在果汁處理、果酒發(fā)酵等工業(yè)中，可有效促進(jìn)飲品澄清和提高果汁出汁率[1-2]。堿性果膠酶則可以應(yīng)用到造紙業(yè)、咖啡和茶發(fā)酵、香精和植物油萃取、工業(yè)廢水處理以及紡織等工業(yè)中，代替?zhèn)鹘y(tǒng)脫膠工藝，既可以提高產(chǎn)品質(zhì)量，又可以減少工業(yè)生產(chǎn)對環(huán)境的污染，為實現(xiàn)環(huán)境友好型工業(yè)做出貢獻(xiàn)[3-5]。目前研究較多的微生物果膠酶為胞外酶，分離純化時常先用硫酸銨沉淀，再用等電聚焦或離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等方法進(jìn)行純化；而胞內(nèi)酶則需要利用超聲波、酶解、去垢劑、研磨等方法破碎細(xì)胞，先釋放出酶，再進(jìn)行純化[6-7]，方法繁瑣。通過基因工程方法則可獲得帶有6-His標(biāo)簽的重組果膠酶，結(jié)合親合層析法可簡單有效地將其分離出來[8-9]。本實驗室前期從1 株芽孢桿菌中成功擴(kuò)增出一段堿性果膠裂解酶基因，并在大腸桿菌E.coli BL21中成功表達(dá)，得到重組菌E.coli BL21/pET-pel。本實驗對工程菌所表達(dá)的胞內(nèi)堿性果膠酶進(jìn)行純化，研究pH值、溫度對酶活力和穩(wěn)定性的影響，以及金屬離子對酶的激活或抑制作用，進(jìn)一步了解重組果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)，為其在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

重組菌E.coli BL21/pET-pel為本實驗前期構(gòu)建并保存。

LB（luria-bertani）液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖10 g/L。

果膠 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；Trisbase、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 上海榕悅生物科技有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 天津博美科生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；中分子質(zhì)量蛋白Marker ?；锟萍加邢薰荆籒,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酞胺、考馬斯亮藍(lán) 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；鎳離子親和層析柱填料 上海銳谷生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

PHS-5CpH計 杭州奧立龍儀器有限公司；V-5000紫外可見分光光度計 上海精科儀器銷售公司；H1650-W高速離心機(jī) 湖南湘儀有限公司；DYCZ-24D雙垂直電泳槽、BG-Power 300電泳儀 北京六一儀器廠；DHG-9123A凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司產(chǎn)品；LDZX 50KB高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD無菌操作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SY-2-4電熱式恒溫水浴鍋、HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

取本實驗室甘油冷凍保藏的大腸桿菌E.coli BL21/ pET-pel菌液50 μL，接種到含LB培養(yǎng)基的試管中，加入100 mg/mL的Amp 5 μL，在37 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)16 h，作為種子液備用。

以1%的接種量，將種子液轉(zhuǎn)接到100 mL（250 mL三角瓶）Amp-LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600nm達(dá)到0.6～0.8，加入100 μL 500 mmol/L的IPTG，37 ℃、150 r/min再次振蕩培養(yǎng)6 h，得到發(fā)酵液，冷藏備用。

1.3.2 粗酶液制備

發(fā)酵液于12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集菌體，將菌體重懸于體積為發(fā)酵液10%的pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl中，用超聲波破碎儀破碎菌體，破碎功率200 W，破碎時間10 min（超聲波5 s，間隔10 s），12 000 r/min離心5 min，收集上清液，即為粗酶液。

李樹化的這一首《如此溫柔》在中國早期鋼琴曲中是較為特別的一首，特別在于它的私密性內(nèi)容和情感。這是他敬獻(xiàn)給愛妻的一首“情歌”，既有西方浪漫主義情調(diào)，也兼有中國傳統(tǒng)的“執(zhí)子之手，與子偕老”的意愿。雖然是譜寫在“圣誕節(jié)”期間，但是音樂并沒有明顯的宗教情緒，而是非常人性化和世俗化的表達(dá)。正是由于它的這個特點，所以李樹化并沒有將其公開發(fā)表，而是深深地收藏在自己的手稿中。西方浪漫主義音樂（尤其是鋼琴音樂）中大都隱含著人類深沉而私密的情感，高尚的人文主義因素深蘊其中，這正是可貴之處。

1.3.3 重組果膠酶純化

E.coli BL21/pET-pel表達(dá)的重組蛋白帶有6-His標(biāo)簽，采用Ni2+親合層析柱純化[10-12]。用pH 7.8的20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液平衡Ni2+柱，上樣3 倍柱體積的粗酶液，用pH 7.8的10 mmol/L咪唑溶液洗滌，去除雜蛋白，再用pH 7.8的200 mmol/L咪唑溶液洗脫，得到目的蛋白，收集流出液冷藏備用。

1.3.4 重組果膠酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide pelelectrophoresi，PAGE）分析

蛋白電泳膠為12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣液為鎳柱純化的果膠酶液、粗酶液和未加入誘導(dǎo)劑時的E.coli BL21/pET-pel細(xì)胞裂解液，以標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白作為對照，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.5 重組果膠酶酶活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸法，即DNS法測定[13-14]。在試管中加入900 μL 2.5 g/L果膠底物，100 μL酶液，于50 ℃水浴10 min，加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)，在100 ℃沸水中加熱5 min，冷卻后于540 nm波長處測定OD值。用100 ℃加熱5 min滅活的酶液作為空白對照組。結(jié)果與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得出酶活力計算公式。規(guī)定在上述條件下，每1 min催化果膠生成1 μmol半乳糖醛酸為一個酶活力單位（U）；單位質(zhì)量（mg）的蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)為比活力（U/mg）。

式中：t為反應(yīng)時間/min；ODi540nm為平行樣光密度值；OD540nm對照樣光密度值；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；180為葡萄糖的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.6 蛋白含量測定

采用Bradford法，即用考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，以牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)，測定蛋白含量。

1.3.7 重組果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.7.1 重組果膠酶作用的最適pH值及其pH穩(wěn)定性分析

在50 ℃下測定重組果膠酶在pH 7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0時的酶活性，確定其最適pH值；將該酶分別在pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的條件下37 ℃水浴1 h，在pH 10.0的反應(yīng)條件下測定酶活性，分析其pH值穩(wěn)定性。

1.3.7.2 重組果膠酶作用的最適溫度和熱穩(wěn)定性分析

在重組果膠酶作用的最適pH值下，分別測定其在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃條件下的酶活性；并在50、60、70、80 ℃的溫度下將重組果膠酶保溫5、10、20、30 min 后，于50 ℃反應(yīng)10 min測定剩余酶活性，以未保溫測得的酶活力定為100%，分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.7.3 金屬離子對重組果膠蛋白酶作用的影響

在含有1 mmol/L不同金屬離子（Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Li+、Al3+）的環(huán)境中，測定重組果膠酶的酶活性，將未加金屬離子的酶活力定為100%，觀察金屬離子對酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組果膠酶純化結(jié)果

表1 重組果膠酶的純化結(jié)果Table1 Purification of recombinant pectinase

圖1 重組果膠酶SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE of recombinant pectinase

由表1可知，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后，酶比活力由39.63 U/mg 提高到67.58 U/mg，純化1.71倍，回收率達(dá)88.5%。SDS-PAGE 分析如圖1所示，E.coli BL21/pET-pel裂解液中蛋白條帶較多，加入誘導(dǎo)劑后培養(yǎng)6 h的較未加入誘導(dǎo)劑的細(xì)胞裂解液在大約44 kD處出現(xiàn)蛋白條帶，純化后蛋白條帶單一。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白對比可知，該重組酶分子質(zhì)量約為44 kD，與經(jīng)Vecter NTI Explorer軟件對重組果膠酶氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測分子質(zhì)量相符，可確定所得純化蛋白為重組果膠酶，且達(dá)到電泳純。

2.2 pH值對重組果膠酶活性的影響

圖2 pH值對重組果膠酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on the activity of recombinant pectinase

圖3 重組果膠酶的pH值穩(wěn)定性Fig.3 pH stability of recombinant pectinase

酶催化需要其適宜的pH值環(huán)境，由圖2可知，此重組果膠酶的最適pH值范圍為9.0～9.5；由圖3可知，在pH 7.0～10.0之間較穩(wěn)定，剩余相對酶活力可保持在90%以上，而在pH 5.0以下，其穩(wěn)定性迅速下降，尤其在pH 2.0、3.0時該酶幾乎失去活性。

2.3 溫度對重組果膠酶活性的影響

圖4 溫度對重組果膠酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of recombinant pectinase

圖5 重組果膠酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of recombinant pectinase

由圖4可知，該酶的最適溫度為50 ℃，此時酶活力可達(dá)到168.77 U/mL，最適溫度范圍在45～55 ℃之間，酶活力保持在160 U/mL以上，65 ℃及以上酶活性迅速下降；由圖5可知，在50 ℃下保溫30 min，重組果膠酶酶活性基本不變，在60 ℃保溫30 min酶活力還可保持40%以上，在70、80 ℃保溫30 min，酶基本失活。

2.4 金屬離子對重組果膠酶活性的影響

由表2可知，在1 mmol/L 離子濃度條件下，Zn2+、Ni2+、Ca2+、Co2+和Al3+均可提高果膠酶的活性，其中Ca2+和Co2+對果膠酶的促進(jìn)作用較強(qiáng)，分別提高66%和74%，Zn2+、Al3+和Ni2+對果膠酶的促進(jìn)程度較小，分別提高16%、19%和14%。Fe3+、Fe2+、Mn2+和Cu2+對重組果膠酶活性有不同程度的抑制作用，F(xiàn)e3+、Mn2+和Cu2+的抑制作用為10%左右，而Fe2+對酶有較強(qiáng)的抑制作用，可使重組果膠酶喪失47%的活力。Mg2+和Li+對果膠酶活性基本沒有影響。

表2 金屬離子對重組果膠酶活性的影響Table2 Effects of various metal ions on the activity of recombinant pectinase

3 結(jié)論與討論

本實驗用鎳柱純化重組菌胞內(nèi)的果膠酶，得到電泳純的重組果膠酶，回收率為88%，純化倍數(shù)可達(dá)1.71；SDS-PAGE檢測表明，重組酶分子質(zhì)量約為44 kD，與相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]報道的重組果膠酶分子質(zhì)量大小在38～46 kD之間相符。

已報道的堿性果膠酶最適pH值為8.0～l0.0，最適溫度范圍在30～80 ℃，多數(shù)為50～60 ℃[17]，不同來源的果膠酶酶學(xué)性質(zhì)有一定差異。Li Zuming等[18]報道的堿性果膠酶最適反應(yīng)pH值為10.0，可在pH 8.0～10.0、溫度不大于40 ℃的條件下保持穩(wěn)定；古麗斯瑪依·艾拜都拉等[19]研究的堿性果膠酶最適作用pH值為10.0，在pH 9.0～12.0的范圍內(nèi)有較高活性和穩(wěn)定性；Mei Yanzhen等[20]構(gòu)建的工程菌表達(dá)的果膠酶最適作用pH值為10.0，在pH 9.5～10.5范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適作用溫度為80 ℃。本研究中的重組果膠酶最適作用條件與報道的作用范圍相吻合，最適反應(yīng)pH值范圍為9.0～9.5，條件溫和，在pH 7.0～10.0之間相對穩(wěn)定，范圍較廣泛。作用的最適溫度范圍為45～55 ℃，在50 ℃下保溫30 min，可保持90%以上活性，熱穩(wěn)定性良好。

不同離子在特定條件下可以作為酶的抑制劑或催化劑。Yuan Peng等[21]報道50 μmol/L的Ca2+可以使重組果膠酶酶活提高1.8 倍，Cr3+、Pb2+可抑制果膠酶活性；Li Xiaoman等[22]研究的重組果膠酶在0.5 mmol/L Ca2+的促進(jìn)下酶活可提高7 倍，Ba2+可以使其嚴(yán)重失活；劉麗萍等[23]研究的果膠裂解酶在Ca2+濃度為0.75 mmol/L時酶活力最高；張菊等[24]也報道Ca2+為大多數(shù)果膠酶的激活劑，Co2+和Fe2+等可抑制果膠酶活性。本研究中，在1 mmol/L離子濃度的條件下，Ca2+和Co2+使重組果膠酶酶活力提高66%～74%，可作為促進(jìn)劑使用，Zn2+、Al3+和Ni2+對果膠酶的促進(jìn)作用較小，F(xiàn)e3+、Fe2+、Mn2+和Cu2+對重組果膠酶活力有不同程度的抑制作用，其中Fe2+對該酶有較強(qiáng)的抑制作用。Co2+對重組果膠酶激活作用未見報道，可能由于此酶的活性中心具有區(qū)別于其他果膠酶的基團(tuán)，與Co2+作用發(fā)生了可促進(jìn)酶催化的變構(gòu)，從而使酶活力提高。

通過對基因工程菌E.coli BL21/pET-pel重組果膠酶酶學(xué)性質(zhì)分析，該酶作用條件溫和，并且在該條件下性質(zhì)穩(wěn)定。今后再從基因工程上進(jìn)一步研究，以提高該堿性果膠酶基因的表達(dá)量，以期該酶可以工業(yè)化應(yīng)用。

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Purification and Characterization of Recombinant Pectinase from Genetically Engineering Strain Escherichia coli BL21/pET-pel

XU Wei, YAO Xiao-jing, FU Da-wei
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The recombinant pectinase expressed in Escherichia coli BL21/pET-pel was purified by ultrasonic cell disruption and nickel ion affinity chromatography, and detected using SDS-PAGE. Its enzymatic characteristics were analyzed. The results showed that purification fold of the recombinant pectinase was 1.71, and recovery was 88.5%. Molecular weight of the recombinant pectinase was approximately 44 kD. Its optimal temperature and pH were 45-55 ℃ and 9.0-9.5. It was stable at pH 7.0-10.0. When the recombinant pectinase was incubated for 30 min at 60 ℃, the relative activity was approximately 40%. Different metal ions revealed different effects on the recombinant pectinase, which was activated by Ca2+and Co2+but inhibited by Fe2+.

recombinant pectinase; intracellular enzyme; nickel ion affinity chromatography; enzymatic characteristic

Q815

A

1002-6630（2014）23-0245-04

10.7506/spkx1002-6630-201423047

2014-06-24

徐偉（1963—），女，教授，博士，研究方向為微生物發(fā)酵工程。E-mail：xuw@hrbcu.edu.cn