紫甘薯花色素與胰蛋白酶相互作用特性

劉 碩，王 萌，朱少華，姜 紅，李小定

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

紫甘薯花色素與胰蛋白酶相互作用特性

劉 碩，王 萌，朱少華，姜 紅，李小定*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

測(cè)定紫甘薯花色素與胰蛋白酶反應(yīng)前后酶的催化活性、催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)并采用紫外光譜法、熒光光譜法和紅外光譜法研究紫甘薯花色素與胰蛋白酶相互作用 特性。結(jié)果表明：紫甘薯花色素對(duì)胰蛋白酶催化活性有明顯的抑制作用，抑制類型為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)Ki=6.16×10－4mmol/L，當(dāng)紫甘薯花色素與胰蛋白酶的物質(zhì)的量比為140∶1，在 37 ℃反應(yīng) 15 min，抑制率達(dá)到38.61%，而反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化活性的影響不明顯；紫甘薯花色素可使胰蛋白酶的內(nèi)源熒光猝滅，猝滅類型為靜態(tài)猝滅，室溫下猝滅常數(shù)Kq為1.73×1012L/（mol·s），結(jié)合常數(shù)KA為3.88×104L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為0.86；熱力學(xué)參數(shù)確定兩者之間的作用力主要為氫鍵和范德華力；根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論得出它們的結(jié)合距離為3.56 nm；紅外光譜經(jīng)過(guò)去卷積、二階導(dǎo)數(shù)處理得知與紫甘薯花色素作用后胰蛋白酶的α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高。

紫甘薯花色素；胰蛋白酶；酶學(xué)性質(zhì)；紫外光譜；熒光光譜；紅外光譜

胰蛋白酶是一種人和動(dòng)物腸道內(nèi)的蛋白水解酶，在消化和新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。它易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。胰蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量為23 300，其單一肽鏈含有233 個(gè)氨基酸殘基和六對(duì)二硫鍵，其結(jié)構(gòu)以β-折疊為主，屬于絲氨酸蛋白酶家族。近年來(lái)關(guān)于小分子與胰蛋白酶的研究表明，2-氨基苯丙噻唑、蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素都對(duì)胰蛋白酶有抑制作用，而油酸鈉對(duì)其活性影響不明顯；2-氨基苯丙噻唑和油酸鈉通過(guò)氫鍵及范德華力與胰蛋白酶相互作用，諾氟沙星和鹽酸環(huán)丙沙星通過(guò)氫鍵及疏水相互作用與胰蛋白酶相互作用；2-氨基苯丙噻唑、諾氟沙星和鹽酸環(huán)丙沙星、蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素都能引起胰蛋白酶靜態(tài)猝滅，而油酸鈉使胰蛋白酶發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅；此外，研究還發(fā)現(xiàn)蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素與胰蛋白酶形成復(fù)合物能提高胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性；而胰蛋白酶對(duì)上述類黃酮的抗氧化作用起到抑制效果[1-6]。以上對(duì)于小分子與胰蛋白酶相互作用的研究多通過(guò)熒光光譜法和紫外光譜法，用紅外光譜研究其相互作用并不多見(jiàn)，另外，由以上研究看出小分子多使胰蛋白酶發(fā)生靜態(tài)猝滅，與胰蛋白酶的結(jié)合主要作用力為疏水作用力、氫鍵和范德華力。

大量流行病學(xué)研究證明食物中的花色苷和植物多酚對(duì)人類許多疾病有預(yù)防和治療作用。目前，對(duì)花色素生理功能的研究集中在抗突變、抗氧化、抗腫瘤、保肝護(hù)肝等[7-9]，而作為胰蛋白酶抑制劑的研究未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)胰蛋白酶抑制劑已引起了醫(yī)學(xué)界的普遍關(guān)注，它對(duì)急慢性胰腺炎、肺氣腫、出血性休克、腦水腫、腫瘤[10]等疾病有一定的療效；在心臟外科手術(shù)方面，能夠防止凝血異常，杜絕手術(shù)過(guò)程中的意外情況。目前，對(duì)上述疾病的處理通常是疾病發(fā)生后用蛋白酶抑制劑類藥品治療，而不是日常生活中通過(guò)飲食預(yù)防。因此根據(jù)紫甘薯花色素對(duì)胰蛋白酶的抑制作用，通過(guò)食用紫甘薯食品對(duì)患有消化系統(tǒng)疾病的患者進(jìn)行日常調(diào)節(jié)與控制，這對(duì)消化系統(tǒng)處于亞健康的人有重要意義。

本研究利用紫外吸收光譜、熒光光譜和紅外光譜對(duì)紫甘薯花色素與胰蛋白酶的相互作用進(jìn)行探究，分析花色素對(duì)胰蛋白酶的抑制能力，探討它們相互作用的規(guī)律，以期為紫甘薯花色素在食品、醫(yī)藥保健行業(yè)中更合理有效的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯花色素 湖北紫鑫生物科技有限公司。

胰蛋白酶、酪蛋白 合肥Biosharp公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，所有溶液都用二次去離子水配制并用Tris-HCl緩沖液保持生理pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、BL-620S電子天平 日本島津公司；F-4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；NEXU S型紅外光譜儀 美國(guó)Nicdet公司；Beta2-8LD真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 花色素對(duì)胰蛋白酶活性的影響及抑制類型判斷

取一定量的花色素和胰蛋白酶溶液，在不同反應(yīng)條件下，測(cè)定反應(yīng)前后胰蛋白酶的催化活性，探討在37 ℃、pH 7.4條件下不同反應(yīng)時(shí)間、花色素濃度比例對(duì)胰蛋白酶催化活性的影響。

胰蛋白酶活性的測(cè)定方法：1 mL胰蛋白酶液和2 mL 2 g/100 mL酪蛋白溶液在37 ℃水浴中保溫10 min后，把酪蛋白加到胰蛋白酶液中，在37 ℃條件下酶解反應(yīng)一段時(shí)間后，加入三氯乙酸終止反應(yīng)。酶解溶液在3 000 r/min離心10 min，取上清液0.8 mL于具塞試管中，加入2 mL福林-酚溶液和3 mL pH 5.0乙酸緩沖液，在37 ℃水浴中顯色10 min，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.1.1 花色素濃度對(duì)胰蛋白酶活 性的影響

根據(jù)上述胰蛋白酶活性測(cè)定方法在反應(yīng)體系胰蛋白酶液中加入2 mL不同濃度梯度的花色素溶液，設(shè)置酶解反應(yīng)為15 min，測(cè)定660 nm波長(zhǎng)處吸光度。抑制率按如下公式（1）計(jì)算。

式中：A空白為空白組吸光度；A樣品為加入胰蛋白酶后吸光度。

1.3.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)胰蛋白酶活性的影響

根據(jù)上述胰蛋白酶活性測(cè)定方法在反應(yīng)體系胰蛋白酶液中加入2 mL質(zhì)量濃度為0.014 3 g/mL的花色素溶液，設(shè)置不同酶解反應(yīng)時(shí)間為5、15、30、60 min，測(cè)定660 nm波長(zhǎng)處吸光度，并按1.3.1.1節(jié)式（1）計(jì)算抑制率。

1.3.1.3 抑制類型判斷

抑制類型判斷：根據(jù)上述胰蛋白酶活性測(cè)定方法在含有2 g/100 mL酪蛋白底物的反應(yīng)體系中，不加花色素溶液，設(shè)置酶解反應(yīng)時(shí)間15 min，分別加入3 種濃度的胰蛋白酶液，測(cè)定660 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以v對(duì)胰蛋白酶液濃度（[En]）作圖，得到一條直線。按此方法，加入確定濃度的花色素溶液再作圖，最終得到兩條直線，以此判斷抑制類型是否可逆。

可逆抑制類型判斷：根據(jù)上述胰蛋白酶活性測(cè)定方法在反應(yīng)體系胰蛋白酶液中加入2 mL某一確定濃度的花色素溶液，設(shè)置酶解反應(yīng)為15 min，分別加入質(zhì)量濃度為4、2、1、0.5 g/100 mL的酪蛋白底物，測(cè)定660 nm波長(zhǎng)處吸光度。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，固定酶和樣品濃度改變底物濃度測(cè)反應(yīng)速率，以1/v和1/[S]作圖，得到兩條直線，來(lái)判斷可逆類型。

1.3.2 紫外吸收差譜

于2.0 mL 5×10－6mol/L的胰蛋白酶溶液中加入不同微量體積的1.0×10－3mol/L花色素溶液，使花色素與胰蛋白酶的終物質(zhì)的量比分別為0、0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，混合均勻后室溫作用30 min，以相同濃度的胰蛋白酶溶液作空白，記錄胰蛋白酶溶液的紫外吸收差譜。

1.3.3 熒光光譜

于2.0 mL 5×10－6mol/L的胰蛋白酶溶液中加入不同體積的1.0×10－3mol/L花色素溶液，混和均勻后作用5 min，以λex=280 nm波長(zhǎng)激發(fā)，在熒光光譜儀上記錄胰蛋白酶溶液的熒光發(fā)射光譜變化。

1.3.4 紅外光譜

將胰蛋白酶溶液和胰蛋白酶與花色素的樣品混合溶液（胰蛋白酶濃度為5×10－6mol/L，花色素濃度為1.5×10－3mol/L）冷凍干燥，凍干后的粉末放在干燥器中待測(cè)。通過(guò)KBr壓片法，得到胰蛋白酶及混合體系的紅外光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 花色素濃度對(duì)胰蛋白酶活性的影響

圖1 花色素加入量對(duì)胰蛋白酶活性的抑制作用Fig.1 Effect of anthocyanins concentration on trypsin activity

類黃酮類化合物與酶蛋白結(jié)合能抑制胰蛋白酶的催化活性，抑制作用與化合物的分子結(jié)構(gòu)和濃度、酶蛋白的氨基酸組成及構(gòu)型等密切相關(guān)[11]。如圖1所示，花色素對(duì)胰蛋白酶的催化活性具有明顯的抑制作用。隨著花色素濃度比例的增加，其對(duì)胰蛋白酶活力的抑制率也明顯增加。當(dāng)花色素濃度繼續(xù)增加到0.03 mmol/L（花色素與胰蛋白酶物質(zhì)的量比約為14∶1），其對(duì)酶活性的抑制效果的增幅變緩?；ㄉ靥砑恿繛?.3 mmol/L（花色素與胰蛋白酶物質(zhì)的量比約為140∶1）時(shí)，對(duì)胰蛋白酶的催化活性抑制率達(dá)到38.61%。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)胰蛋白酶活性的影響

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)胰蛋白酶活性的影響Fig.2 Effect of reaction time on trypsin activity

如圖2所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，花色素對(duì)胰蛋白酶催化活性的抑制作用并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，說(shuō)明花色素和胰蛋白酶能很快完成反應(yīng)。

2.1.3 花色素對(duì)胰蛋白酶抑制類型的判斷

圖3 花色素對(duì)胰蛋白酶的抑制作用機(jī)理判斷Fig.3 Determination of the inhibitory mechanism of anthocyanins on trypsin

圖4 花色素對(duì)胰蛋白酶抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plots of anthocyanins for the inhibition of trypsin

根據(jù)抑制劑與酶的作用方式，以及抑制劑對(duì)酶的作用是否可逆，可將抑制劑作用分為不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用兩大類；根據(jù)可逆抑制劑與底物的關(guān)系，可逆的抑制作用可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。黃酮類化合物與酶蛋白結(jié)合，結(jié)合到酶的活性部位表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，結(jié)合到非活性部位表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[11-12]。觀察圖3，加入花色素后直線斜率改變，而不是向右平移，推斷花色素對(duì)胰蛋白酶的抑制作用是可逆的[13]。由圖4可知，米氏常數(shù)隨抑制劑質(zhì)量濃度的增大而增大，最大反應(yīng)速率保持不變。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程分別可求得花色素在不同加入量下表現(xiàn)的抑制常數(shù)Ki=6.16×10－4mmol/L，花色素對(duì)胰蛋白酶的抑制類型是可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.2 花色素作用胰蛋白酶后的紫外吸收光譜

由圖5可知，隨花色素濃度的升高，胰蛋白酶在220 mn附近處的吸收峰增強(qiáng)并發(fā)生紅移。近紫外區(qū)（200～400 nm）的紫外吸收是共扼體系中：π（成鍵軌道）→π*（反鍵軌道）電子躍遷或非共軛體系中的n（孤對(duì)電子）→π*（反鍵軌道）引起的。蛋白質(zhì)肽鍵有部分雙鍵性質(zhì)，使發(fā)生幾率較小的n（氮上的孤對(duì)電子）→π*躍遷更加難發(fā)生，因此胰蛋白酶220 nm附近的紫外吸收峰推測(cè)是由于肽鍵C=O基團(tuán)的π→π*躍遷所引起[14]，與蛋白質(zhì)的α-螺旋有關(guān)。花色素引起胰蛋白酶紫外吸收峰強(qiáng)度增加和紅移的實(shí)質(zhì)是：胰蛋白酶α-螺旋含量降低且π（成鍵軌道）→π*（反鍵軌道）電子躍遷能量差變小，電子躍遷幾率增加。

圖5 不同濃度花色素作用胰蛋白酶后的紫外吸收光譜Fig.5 UV absorption spectra of trypsin after treatment with anthocyanins at various concentrations

2.3 花色素作用胰蛋白酶后的熒光光譜

2.3.1 花色素對(duì)胰蛋白酶熒光的猝滅效應(yīng)

圖6 不同濃度的花色素對(duì)胰蛋白酶的熒光猝滅效應(yīng)Fig.6 Fluorescence quenching of trypsin by anthocyanins at various concentrations

蛋白分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸均有熒光產(chǎn)生，色氨酸的熒光最強(qiáng)，酪氨酸次之，苯丙氨酸最弱（熒光強(qiáng)度比為100∶9∶0.5）[15]，因此本研究主要探討色氨酸的熒光變化。由圖6可知，隨著花色素濃度增大，胰蛋白酶熒光光譜發(fā)生了熒光峰位移和熒光猝滅。熒光猝滅說(shuō)明色氨酸的空間位置發(fā)生了改變[16]，而熒光峰從339 nm紅移到366 nm，說(shuō)明色氨酸周圍微環(huán)境發(fā)生改變，由疏水變得更加親水[17]。

2.3.2 花色素與胰蛋白酶相互作用的熒光猝滅機(jī)理與結(jié)合常數(shù)

熒光猝滅是由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。熒光猝滅的機(jī)制主要有兩種：靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，猝滅機(jī)制都可用Stern-Volmer方程描述[18]：

式中：F0和F分別是加入猝滅劑前后熒光強(qiáng)度；[Q]是猝滅劑濃度；τ0為生物分子的熒光壽命，約10 ns[19]；Kq為雙分子碰撞猝滅常數(shù)（又稱表觀猝滅常數(shù)）；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，且Ksv=Kqτ0，作花色素對(duì)胰蛋白酶猝滅的F0/F～[Q]曲線，見(jiàn)圖7。

圖7 花色素對(duì)胰蛋白酶熒光猝滅Stern-Volmer曲線Fig.7 Stem-Volmer plots of fluorescence quenching of trypsin by anthocyanins

求得花色素對(duì)胰蛋白酶的表觀猝滅常數(shù)Kq為1.73×1012L/（mol·s）（304 K）、1.91×1012L/（mol·s）（300 K）遠(yuǎn)大于各種猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞常數(shù)2.0×1010L/（mol·s）[19]，此外，Ksv分別為1.73×104L/mol（304 K）、1.91×104L/mol（300 K），猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而降低，因此推斷花色素對(duì)胰蛋白酶的熒光猝滅并不是由于分子擴(kuò)散進(jìn)而發(fā)生動(dòng)態(tài)碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是花色素與胰蛋白酶形成締合物而引起的靜態(tài)猝滅。

在靜態(tài)猝滅中，熒光體的熒光強(qiáng)度與其游離濃度成正比，則有[19]：

以lg[（F0－F）/F]對(duì)lg[Q]作線性擬合（圖8），即可求出花色素與胰蛋白酶的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合點(diǎn)數(shù)n。

圖8 lg[（F0-F ）/ ]與lg[Q]的關(guān)系圖Fig.8 Plot of lg[(F0－F)/F] vs lg[Q]

由圖8求出KA為3.88×104L/mol（304 K），n為 0.86（304 K），結(jié)果表明花色素與胰蛋白酶只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.3.3 花色素與胰蛋白酶相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力

熱力學(xué)參數(shù)和小分子與蛋白質(zhì)之間作用力的關(guān)系如下[18]：

為確定花色素與胰蛋白酶之間相互作用力類型，同時(shí)研究了300 K條件下花色素對(duì)胰蛋白酶的熒光猝滅作用，并求出K=5.92×104L/mol。由式（4）可得ΔH =－80.14 kJ/mol，由式（5）和式（6）可得ΔG=－26.71 kJ/mol，ΔS =－175.75 J/mol。根據(jù)Ross等[20]總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，以小分子與生物大分子反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)的變化判斷小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型的規(guī)律。即當(dāng)ΔS＞0，ΔH＞0為典型的疏水作用力；ΔS＜0，ΔH＜0為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔS＞0，ΔH＜0時(shí)，主要存在靜電相互作用。因此，花色素與胰蛋白酶的結(jié)合是熵減少、自由能降低的自發(fā)過(guò)程（ΔG＜0），又因?yàn)棣＜0，ΔH＜0所以花色素與胰蛋白酶分子間作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。

2.3.4 花色素與胰蛋白酶結(jié)合的距離

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是色氨酸殘基產(chǎn)生的，因此根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論[21]可計(jì)算出小分子在蛋白質(zhì)上的結(jié)合位置與色氨酸殘基之間的距離r，即兩種化合物滿足：1）供能體發(fā)熒光；2）供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體的吸收光譜有足夠的重疊；3）供能體與受能體的最大距離不超過(guò)7 nm。

在實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)胰蛋白酶的熒光發(fā)射光譜和花色素的紫外吸收光譜的重疊圖譜（圖9），應(yīng)用下列公式[22]計(jì)算胰蛋白酶與花色素之間的結(jié)合距離r：

式中：F0和F分別是胰蛋白酶和花色素-胰蛋白酶（物質(zhì)的量比1∶1）的熒光；R0是E = 50%時(shí)的臨界距離；K2為偶極空間取向因子；N為介質(zhì)的折射指數(shù)；Φ為供體胰蛋白酶的熒光量子產(chǎn)率；J為供體胰蛋白酶熒光光譜與受體花色素吸收光譜的重疊積分；Fλ為熒光供體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度；ελ為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。

根據(jù)公式求得花色素與胰蛋白酶的重疊積分J= 8.71×10－14cm3/mol，R0=3.52 nm，E=0.48。花色素和胰蛋白酶之間的結(jié)合距離r=3.56 nm。由于r＜7 nm，且0.5 R0＜r＜1.5 R0，因此推斷花色素和胰蛋白酶發(fā)生了F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移，并引起了熒光猝滅，表明花色素與胰蛋白酶發(fā)生締合。

圖9 花色素的吸收光譜（a）和胰蛋白酶的熒光光譜（b）Fig.9 UV-visible absorption spectrum of anthocyanin (a) and fluorescence emission spectrum of trypsin (b)

2.4 花色素作用胰蛋白酶后的紅外光譜

圖10 花色素-胰蛋白酶的紅外光譜Fig.10 FT-IR spectra of trypsin alone and in the presence of anthocyanins

通過(guò)紅外光譜可以定量地確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)含量變化。由圖10可知，花色素與胰蛋白酶相互作用后1 640 cm－1峰和1 543 cm－1峰位置均發(fā)生位移，說(shuō)明花色素與胰蛋白酶發(fā)生了相互作用，使胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，這可能是由于花色素與胰蛋白酶分子中的C=O和C—N或N—H基團(tuán)發(fā)生了相互作用[23]，也可能是花色素與蛋白質(zhì)分子的多肽鏈之間形成了氫鍵。

圖12 胰蛋白酶（A）及花色素-胰蛋白酶（B）去卷積譜的曲線擬合結(jié)果Fig.12 Fitting curves of amide I (1 700-1 600 cm－1) of free trypsin (A) and anthocyanins-trypsin complex (B)

根據(jù)蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm－1）譜峰歸屬[24]：1 610～1 640 cm－1為β-折疊；1 640～1 650 cm－1為無(wú)規(guī)則卷曲；1 650～1 658 cm－1為α-螺旋；1 658～1 695 cm－1為β-轉(zhuǎn)角。將得到的紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)、去卷積處理，把酰胺Ⅰ帶中未能分辨的峰進(jìn)一步分解為多個(gè)子峰，并指認(rèn)各子峰位置，再通過(guò)曲線擬合的方法，定量地分析胰蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的各個(gè)組分。圖11和圖12表示了花色素-胰蛋白酶體系的二階導(dǎo)數(shù)譜、去卷積譜和曲線擬合結(jié)果。通過(guò)圖12中各譜峰峰面積的比值可得花色素對(duì)胰蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響變化值（表1）。加入花色素后，胰蛋白酶構(gòu)象中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量分別減少6.6%、11.1%和5.0%，β-折疊含量增加了21.7%，說(shuō)明花色素與胰蛋白酶發(fā)生了相互作用，使胰蛋白酶主要構(gòu)象β-折疊含量升高。

表1 胰蛋白酶及花色素-胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table1 Secondary structure contents of free trypsin and anthocyaninstrypsin complex

3 結(jié) 論

紫甘薯花色素對(duì)胰蛋白酶活性存在可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；二者之間發(fā)生了相互作用，且主要作用力為氫鍵和范德華力；花色素通過(guò)靜態(tài)猝滅和能量轉(zhuǎn)移的方式使胰蛋白酶內(nèi)源熒光減弱；二者相互作用后胰蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，主要構(gòu)象β-折疊含量增加。在本研究基礎(chǔ)上，還可通過(guò)圓二色譜和分子模擬進(jìn)一步探討花色素對(duì)胰蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)影響以及二者的結(jié)合位置。

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Interaction between Purple Sweet Potato Anthocyanins and Trypsin

LIU Shuo, WANG Meng, ZHU Shao-hua, JIANG Hong, LI Xiao-ding*
(Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The interaction between purple sweet potato anthocyanins and trypsin was studied by measuring the catalytic activity and reaction kinetics through ultraviolet (UV) absorption, fluorescence and infrared (IR) spectroscopy. The results showed that purple sweet potato anthocyanins had an obvious inhibitory effect on trypsin catalytic activity, and the inhibition was reversible competitive inhibition with an inhibitory constant (Ki) of 6.16 × 10-4mmol/L. When the r eaction between purple sweet potato anthocyanins and trypsin with a mole ratio of 140:1 was carried out at 37 ℃ for 15 min, the inhibitory rate was 38.61%; however, the catalytic activity was not obviously affected by reaction time. Purple sweet potato anthocyanins treatment led to the quenching of intrinsic fluorescence of trypsin. The quenching of trypsin by purple sweet potato anthocyanins was probably a static quenching process with a quenching constant (Kq) of 1.73×1012L/(mol s), and a binding constant (KA) of 3.88×104L/mol. The number of binding sites was 0.86. According to the thermodynamic parameters, hydrogen bonding and van der Waals force played a dominant role in the interaction between the anthocyanins and trypsin. The distance between donor and acceptor in anthocyanin-trypsin was calculated as 3.56 nm, based on the equations from F?rster non-radiation energy transfer theory. The IR spectra revealed the conformational change of trypsin caused by binding, thus leading to a decrease of α-helix and an increase of β-fold.

purple sweet potato anthocyanins; trypsin; enzym atic properties; ultraviolet (UV) absorption spectroscopy; fluorescence spectroscopy; infrared (IR) spectroscopy

TS201.2

A

1002-6630（2014）23-0232-06

10.7506/spkx1002-6630-201423045

2014-01-07

劉碩（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：liushuo@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：李小定（1968—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食油脂與植物蛋白工程、天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：lixd@mail.hzau.edu.cn