溫度和接種量對攪打奶油中金黃色葡萄球菌生長及產(chǎn)腸毒素的影響

王 彤，林 露，嚴(yán)維凌,*，歐 杰，陳 敏

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235；3.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336）

溫度和接種量對攪打奶油中金黃色葡萄球菌生長及產(chǎn)腸毒素的影響

王 彤1，林 露2，嚴(yán)維凌2,*，歐 杰1，陳 敏3

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235；3.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336）

目的：研究金黃色葡萄球菌在攪打奶油中的生長以及產(chǎn)毒特性。方法：將不同濃度的初始接種量的產(chǎn)A型腸毒素金黃色葡萄球菌菌液接種到奶油中并攪打成型，低接種量控制在2～3（lg（CFU/g）），高接種量控制在4（lg（CFU/g））以上。定時測量不同貯存溫度條件下奶油中的金黃色葡萄球菌的菌落總數(shù)以及產(chǎn)毒狀況。結(jié)果：36 ℃條件下生長速率最快，其他溫度條件下依次降低；低初接種量水平下，只有36 ℃條件下于27 h檢測到產(chǎn)生毒素，其他溫度條件下未檢測到毒素產(chǎn)生；高初接種量水平條件下，在36 ℃于12 h、25 ℃于24 h、15 ℃于66 h檢測到產(chǎn)生毒素，5 ℃條件下金黃色葡萄球菌既不生長，又不產(chǎn)毒。結(jié)論：隨著溫度的升高，金黃色葡萄球菌的生長速率隨之升高，產(chǎn)腸毒素的時間也隨之縮短，高初始接種量水平腸毒素產(chǎn)生的時間短于低初始接種量水平，腸毒素的產(chǎn)生時間為一般在對數(shù)期的中后期，此時金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)≥6（lg（CFU/g））。

金黃色葡萄球菌；腸毒素；攪打奶油

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種人畜共患病的重要致病菌。據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心報告，金黃色葡萄球菌索引引發(fā)的食物中毒事件位居第二位，僅次于大腸埃希菌，占細(xì)菌引起的食物中毒的33%。在加拿大發(fā)生的概率更高，占45%。我國每年亦發(fā)生此類中毒事件，各地均有報道。金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生一系列的致病物質(zhì)如毒素、酶類和菌體的一些成分，其中腸毒素（Staphylococcus aureus enterotoxins，簡稱SEs）在該菌的致病性中起著重要的作用[1-13]。

攪打奶油又稱稀奶油，乳脂含量35%左右，經(jīng)攪打打發(fā)后體積可增加數(shù)倍，從流動狀變?yōu)榉橇鲃訝畈⒕哂锌伤苄?，是制作裱花蛋糕、夾芯蛋糕、泡芙、提拉米蘇等西式烘焙食品的重要原料。商品化的攪打奶油都經(jīng)過超高溫瞬時滅菌（ultra high temperature treated，UHT）滅菌和無菌灌裝，不含致病菌，但一旦打開包裝，其后的加工貯藏環(huán)節(jié)包括攪打、裱花等都涉及到大量的人工操作，并且長時間暴露在空氣中，而金黃色葡萄球菌作為自然界中常見的微生物，在30%～50%健康成年人的皮膚、黏膜表面及鼻咽部以及空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，加上乳和乳制品是金黃色葡萄球菌的主要宿主，因此對于制作蛋糕等烘焙食品的面包房，一旦由于衛(wèi)生消毒措施的不到位，有可能造成金黃色葡萄球菌污染加工好的食品并導(dǎo)致食物中毒[14]。

對于食品中金黃色葡萄球菌的生長規(guī)律及其產(chǎn)腸毒素條件的研究，是開展風(fēng)險評估、食品安全標(biāo)準(zhǔn)制定、產(chǎn)品生產(chǎn)衛(wèi)生操作規(guī)范形成的重要技術(shù)依據(jù)和支撐。從理論上講，金黃色葡萄球菌的生長規(guī)律及其產(chǎn)腸毒素的條件已非常清楚，但這都是基于培養(yǎng)基的理想狀態(tài)下獲得的數(shù)據(jù)。由于細(xì)菌作為原核生物，營養(yǎng)狀況、環(huán)境因素對其生長和基因的表達(dá)起著十分重要的作用[15]。不同的食品由于其營養(yǎng)成分的構(gòu)成、貯存條件的差異等，金黃色葡萄球菌在不同食品中的生長規(guī)律及其產(chǎn)腸毒素的條件也完全不同，因此國內(nèi)外已有科學(xué)家對各種食品中的金葡菌生長產(chǎn)毒規(guī)律進(jìn)行了研究，例如王小紅等[16]研究了原料奶接種金葡菌后在酸奶發(fā)酵中是否產(chǎn)毒素的可能性，王定德等[17]研究了金葡菌在蘑菇罐頭中的生長產(chǎn)毒素規(guī)律；Nipa等[18]研究了一種豬肉發(fā)酵肉制品中金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素的風(fēng)險；Notermans等[19]則研究在在肉類以及蔬菜中金黃色葡萄球菌的生長以及產(chǎn)毒規(guī)律；Doan等[20]將金葡菌株接種到油炸鮮切脫皮土豆條中，在26.7 ℃貯藏，經(jīng)過5 h可以檢測出腸毒素，因此認(rèn)為薯條發(fā)生金黃色葡萄球菌食物中毒的風(fēng)險非常高。但目前國外內(nèi)對于金黃色葡萄球菌在攪打奶油中生長及產(chǎn)腸毒素的規(guī)律尚無相關(guān)的研究報道。

雖然金黃色葡萄球菌普遍存在于環(huán)境、人體和生鮮食品中，但并非所有菌株都產(chǎn)腸毒素。為使本實驗的研究結(jié)論具有通用性和普遍性，本實驗選擇了一株產(chǎn)最常見、毒力最強(qiáng)的腸毒素A的金黃色葡萄球菌菌株作為研究對象，將其培養(yǎng)、接種到攪打奶油中，研究其生長和產(chǎn)腸毒素的規(guī)律。為奶油的安全貯存和安全風(fēng)險評估提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)A型腸毒素的金黃色葡萄球菌（SA14966） 上海市食品研究所保存；1 L裝安佳淡奶油 市購；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂 上海疾控華康科技開發(fā)公司；Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)、亞碲酸鹽卵黃增菌液、BHI肉湯 北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；Tecra?微孔板法葡萄球菌腸毒素A-E快速檢測試劑盒、Petrifilm?金黃色葡萄球菌測試片 美國3M公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1000-Ⅱ-A2生物安全柜、THZ-8AA氣溶恒溫振蕩器 金壇市城西天竟實驗儀器廠；冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海醫(yī)療機(jī)械七廠；隔水式恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心器儀器有限公司；酶標(biāo)儀 熱電（上海）機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將凍藏的菌液解凍，用移液管吸取1 mL菌液加入50 mL已經(jīng)滅菌的營養(yǎng)肉湯中，置于37 ℃、100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18～20 h，之后進(jìn)行平板劃線分離置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到單菌落。

1.3.2 菌液的制備與除毒

根據(jù)Peter等[21]的方法并進(jìn)行修改，于超凈臺內(nèi)挑取一環(huán)接種于滅菌的LB肉湯中，于37 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)18～20 h；吸出50 mL菌液于4 ℃、10 000 r/min離心20 min；棄去上清液后，細(xì)胞沉淀加入用冷的50 mL滅菌的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（K2HPO4-KH2PO4，pH 7）混勻；于4 ℃、10 000 r/min離心20 min；棄去上清液；再將細(xì)胞沉淀加入用冷的50 mL滅菌的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（K2HPO4-KH2PO4，pH 7）混勻；于4 ℃、10 000 r/min離心20 min；棄去上清液，再將細(xì)胞沉淀加入50 mL滅菌的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（K2HPO4-KH2PO4，pH 7）混勻，得到菌種原液。以上2 次沖洗的目的是保證制得菌種原液只含有金黃色葡萄球菌的細(xì)胞，而沒有金黃色葡萄球菌的腸毒素。

1.3.3 不同實驗溫度和接種量的設(shè)計

為了模擬攪打奶油中金黃色葡萄球菌的不同污染程度，初始菌種量分別設(shè)置為高接種量和低接種量，低接種量控制在2～3（lg（CFU/g）），高接種量控制在4（lg（CFU/g））以上。

將菌液接入到1 L淡奶油中進(jìn)行攪拌打發(fā)均勻，為了了解在不同貯存溫度條件下金黃色葡萄球菌的生長和產(chǎn)腸毒素規(guī)律，本實驗分別設(shè)置（5±1）、（15±1）、（25±1）、（36±1）℃作為攪打奶油的貯存溫度。其中（5±1）℃的環(huán)境條件下菌落總數(shù)每隔12 h進(jìn)行一次計數(shù)，共計13 次；（15±1）℃環(huán)境條件下每隔6 h計數(shù)一次，共計13 次；（25±1）℃環(huán)境條件下每隔4 h進(jìn)行一次計數(shù)，共計13 次；（35±1）℃每隔3 h進(jìn)行一次計數(shù)，共計13 次。每次計數(shù)稱取10 g樣品至盛有90 mL 0.9%滅菌的生理鹽水中，每次計數(shù)測量2 個平行樣。采用Petrifilm?金黃色葡萄球菌測試片進(jìn)行計數(shù)[22]。同時，另取20 g左右樣品留樣用來測定腸毒素。

1.3.4 金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測

選用Tecra?微孔板法葡萄球菌腸毒素A-E快速檢測試劑盒。為了檢測某個時期的攪打奶油中是否有腸毒素出現(xiàn)，每次取1 mL奶油樣品和50 μL樣品添加液充分混合后，按照Tecra?微孔板法葡萄球菌腸毒素A-E快速檢測試劑盒的說明書對樣品分析，結(jié)果用酶標(biāo)儀讀取吸光度（A），根據(jù)試劑盒說明書：將酶標(biāo)儀的波長調(diào)節(jié)為405 nm，A405nm≥0.2為陽性，表明產(chǎn)毒，當(dāng)A405nm＜0.2為陰性，表明不產(chǎn)毒或者分泌腸毒素的量不能達(dá)到顯示毒性的水平；此時，PC（陽性對照物）的A405nm≥1.0，NC（陰性對照物）的A405nm≤0.2，讀數(shù)有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 36 ℃條件下攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長和產(chǎn)腸毒素情況

圖1 36 ℃攪打奶油中低接種量水平（a）和高接種量水平（b）下金黃色葡萄球菌的生長以及產(chǎn)毒情況Fig.1 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 36 ℃

由圖1可知，36 ℃條件下，無論是低初接種量還是高初接種量的情況下，都能快速進(jìn)入對數(shù)期，無明顯的延滯期。低接種量的情況下，初始菌落總數(shù)為3.1（lg（CFU/g）），在27 h檢測到產(chǎn)毒，此時菌落總數(shù)為6.08（lg（CFU/g））；高接種量的情況下，初始菌落總數(shù)為4.2（lg（CFU/g）），24 h達(dá)到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)維持在7.8（lg（CFU/g）），在12 h檢測到毒素產(chǎn)生，此時的菌落總數(shù)為6.88（lg（CFU/g））。36 ℃條件下，在18 h后，打發(fā)成固態(tài)的裱花奶油的固態(tài)結(jié)構(gòu)已經(jīng)坍塌并融化成液態(tài)，有異味產(chǎn)生，失去食用價值。

2.2 25 ℃條件下攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長狀況以及產(chǎn)腸毒素情況

圖2 25 ℃攪打奶油中低接種量水平（a）和高接種量水平（b）下金黃色葡萄球菌的生長以及產(chǎn)毒情況Fig.2 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 25 ℃

由圖2可知，25 ℃條件下，金黃色葡萄球菌較36 ℃條件下的生長曲線以及產(chǎn)毒情況有著明顯不同：低接種量初始菌落總數(shù)為3.0（lg（CFU/g）），有明顯的延滯期，4 h后達(dá)到生長對數(shù)期，56 h后尚未達(dá)到穩(wěn)定期，此時菌落總數(shù)為5.6（lg（CFU/g））左右，未檢測到有毒素產(chǎn)生。高接種量初始菌落總數(shù)為4.2（lg（CFU/g）），無明顯的延滯期，32 h達(dá)到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)維持在6.7（lg（CFU/g））左右，在24 h檢測到毒素的產(chǎn)生，此時的菌落總數(shù)為6.34（lg（CFU/g））。25 ℃條件下，已經(jīng)打發(fā)成固態(tài)的裱花奶油在28 h后泡沫結(jié)構(gòu)已坍塌并融化成液態(tài)，有異味產(chǎn)生，失去食用價值。

2.3 15 ℃條件下攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長以及產(chǎn)腸毒素情況

圖3 15 ℃攪打奶油中低接種量（a）和高接種量（b）水平下金黃色葡萄球菌的生長以及產(chǎn)毒情況Fig.3 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 15 ℃

由圖3可知，15 ℃條件下，金黃色葡萄球菌生長緩慢：低接種量情況下，初始菌落總數(shù)為2.7（lg（CFU/g）），48 h時開始進(jìn)入對數(shù)期，整個實驗生長過程中未檢測出有毒素產(chǎn)生。高接種量的情況下，初始菌落總數(shù)為4.23（lg（CFU/g））左右，在42 h后開始快速增長，在66 h檢測到毒素的產(chǎn)生，此時菌落總數(shù)為6.16（lg（CFU/g））左右。15 ℃條件下，在48 h后，大部分已打發(fā)成固態(tài)的裱花奶油的泡沫結(jié)構(gòu)已坍塌并融化成液態(tài)，有異味產(chǎn)生，失去食用價值。

2.4 5 ℃條件下攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長以及產(chǎn)腸毒素情況

由圖4可知，5 ℃條件下，無論低接種量和高接種量的情況下，金黃色葡萄球菌幾乎不生長或著生長極為緩慢，在整個生長過程中并未檢測到有毒素產(chǎn)生，整個過程中已打發(fā)的裱花奶油狀態(tài)沒有發(fā)生明顯的改變。

圖4 5 ℃攪打奶油中低接種量（a）和高接種量（b）水平下金黃色葡萄球菌的生長以及產(chǎn)毒情況Fig.4 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 5 ℃

3 討 論

由上述實驗結(jié)果可知，溫度對金黃色葡萄球菌在攪打奶油的生長以及產(chǎn)腸毒素有著很大的關(guān)系，無論是在高接種水平下還是在低接種水平下，金黃色葡萄球菌的生長速率與溫度呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。在36 ℃條件下，金黃色葡萄球菌生長無明顯的延滯期，菌種接入后迅速進(jìn)入對數(shù)期；在15 ℃條件下，無論低接種量水平還是高接種量水平，都要經(jīng)過約40 h的延滯期后進(jìn)入對數(shù)期；而在5 ℃條件下，金黃色葡萄球菌幾乎停止了生長。其次，雖然金黃色葡萄球菌的最適生長溫度為36 ℃，但在25、15 ℃溫度條件下也能產(chǎn)腸毒素，但隨著溫度的降低，從接入金黃色葡萄球菌菌液到開始產(chǎn)腸毒素的時間也隨之延長，在高接種量的條件下，36、25、15 ℃溫度時的產(chǎn)毒時間分別為12、24、66 h。但在5 ℃條件下，金黃色葡萄球菌幾乎停止生長，也不產(chǎn)毒素。

接種量的高低也是影響金黃色葡萄球菌的生長和產(chǎn)毒素的重要條件，在36 ℃時，無論高低接種量金黃色葡萄球菌的生長均無明顯延滯期；在25 ℃時，高接種量也無明顯延滯期，而低接種量至少有4 h的延滯期；而在15 ℃條件下，低接種量水平的延滯期要比高接種量水平長6 h。其次，高初始接種量從接入金黃色葡萄球菌菌液到開始產(chǎn)腸毒素的時間要明顯短于低接種量，在36 ℃時，高、低接種量的產(chǎn)毒時間分別為12 h和27 h；25 ℃時，高接種量的產(chǎn)毒時間為24 h，而低接種量在60 h尚未產(chǎn)毒；而在15 ℃條件下，高接種量的產(chǎn)毒時間為66 h，而低接種量始終未能檢出產(chǎn)毒。無論高低接種量，金黃色葡萄球菌在攪打奶油中產(chǎn)生的毒素的金葡菌菌落總數(shù)≥6（lg（CFU/g））。以上結(jié)論與Liliana[23]和Aimo[24]等相關(guān)研究結(jié)果具有一致性，

從上述實驗結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素時間與其生長的階段密切相關(guān)，無論高、低接種量，金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素的時間都是在其生長對數(shù)期的中晚期，這在Fujikawa等[25]在牛奶中進(jìn)行的實驗結(jié)果相近。如果從36 ℃和25 ℃的實驗結(jié)果做一個更進(jìn)一步的估算，可以看出金黃色葡萄球菌產(chǎn)腸毒素的時間大約是其對數(shù)期的2/3的階段，此時金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)≥6（lg（CFU/g））。在本實驗中，25 ℃和15 ℃、低接種量的情況下金黃色葡萄球菌毒素均未檢出，但如果觀察其生長曲線，可發(fā)現(xiàn)到實驗結(jié)束時，其生長尚處于對數(shù)期，遠(yuǎn)未達(dá)到穩(wěn)定期，只是此時的攪打奶油早已失去食用價值而導(dǎo)致實驗終止。如果忽略其食用價值而延長實驗，在25 ℃和15 ℃、低接種量的情況下金葡菌腸毒素還是存在檢出的可能性。

綜上所述，攪打奶油是金黃色葡萄球菌良好的培養(yǎng)劑，一旦受到污染并且條件適宜，金黃色葡萄球菌生長迅速并且在較短的時間就可產(chǎn)生腸毒素；即便是較低的貯藏溫度條件（15 ℃），依然不能完全阻止金黃色葡萄球菌的生長和產(chǎn)腸毒素。因此作為使用攪打奶油的食品企業(yè)必須做好操作環(huán)節(jié)的衛(wèi)生，盡可能減少和防止的金黃色葡萄球菌污染，同時產(chǎn)品必須貯存于5 ℃以下的環(huán)境中，并且要防止溫度波動，這樣方可有效防止由金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的食物中毒事件。

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Effects of Storage Temperature and Inoculum Amount on the Growth of Staphylococcus aureus and Production of Enterotoxin in Whipping Cream

WANG Tong1, LIN Lu2, YAN Wei-ling2,*, OU Jie1, CHEN Min3
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Food Research Institute, Shanghai 200235, China; 3. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China)

Objective: The growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin in whipping cream were studied. Methods: Two concentration levels of Staphylococcus aureus which produce enterotoxin were inoculated into whipping cream stored at different temperatures; the low initial inoculum level was controlled in 2-3 (lg(CFU/g)), and the high level was over 4 (1g(CFU/g)). The plate counts of Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxin were tested regularly. Results: The growth rate decreased with decreasing temperature. At the low inoculation level, Staphylococcus aureus enterotoxin was detected only at 36 ℃ after 27 h. At the moderate temperature (25, 15 ℃), no Staphylococcus aureus enterotoxin was detected. At the high inoculation level, staphylococcus enterotoxin were detected at 36 ℃after 12 h, 25 ℃after 24 h and 15 ℃ after 66 h. At the low temperature (5 ℃), Staphylococcus aureus did not grow and no staphylococcus enterotoxin was detected. Conclusion: As temperature rose, the growth rate of Staphylococcus aureus increased and the time to produce enterotoxin was shortened. The time to produce enterotoxin for Staphylococcus aureus at the high initial inoculation level was shorter than at the low initial inoculation level. The enterotoxin was generated in the late lag phase where the plate count of Staphylococcus aureus reached 6 (1g(CFU/g)).

Staphylococcus aureus; enterotoxin; whipping cream

TS252.52

A

1002-6630（2014）23-0210-05

10.7506/spkx1002-6630-201423041

2014-06-25

上海市科委應(yīng)用技術(shù)開發(fā)專項資金項目（2013-116）

王彤（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：1007944467@qq.com

*通信作者：嚴(yán)維凌（1967—），男，教授級高級工程師，本科，研究方向為食品安全和控制。E-mail：yanwling@tom.com