玉米秸稈糖醇發(fā)酵產(chǎn)丁二酸及表征

葉小金，王紅蕾，王曉俊，徐洪章，薛冬樺

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012 ）

玉米秸稈糖醇發(fā)酵產(chǎn)丁二酸及表征

葉小金，王紅蕾，王曉俊，徐洪章，薛冬樺*

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012 ）

以玉米秸稈糖醇液為原料，考察產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）X-1對不同單一碳源的同化能力，并驗(yàn) 證產(chǎn)琥珀酸放線桿菌可同化利用玉米秸稈糖醇液。利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為：玉米秸稈糖醇液初始還原糖質(zhì)量濃度42.81 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度12.53 g/L、緩沖劑MgCO3質(zhì)量濃度15.90 g/L，經(jīng)5 L發(fā)酵規(guī)模實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵周期48 h，丁二酸產(chǎn)率為85.1%，還原糖利用率為85.4%。經(jīng)紅外光譜和核磁共振表征其發(fā)酵產(chǎn)物為生物基丁二酸。

丁二酸；發(fā)酵；玉米秸稈糖醇液；產(chǎn)琥珀酸放線桿菌

丁二酸（succinic acid）是生物質(zhì)煉制產(chǎn)品工程中最重要的碳四平臺化合物，在化工、材料、醫(yī)藥、食品領(lǐng)域有著廣泛的用途[1-3]。丁二酸作為C4平臺化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等重要大宗化學(xué)品和專用化學(xué)品的基本原料，也是合成聚丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇丁二酸酯和聚丙二醇丁二酸酯等可生物降解高分子材料的原料[4-6]。

隨著石油資源日益枯竭，生物質(zhì)資源高效轉(zhuǎn)化為丁二酸，是近年來國際上的研究熱點(diǎn)。美國能源部將丁二酸列為12 種最有潛力的大宗生物基化學(xué)品的第一位[7]。國外研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)陸續(xù)報(bào)道，乳清、芭蕉芋糖漿、棉花秸稈和甘蔗糖蜜等工農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)生物基丁二酸[8-11]。國內(nèi)積極推進(jìn)以玉米秸稈為原料的非糧食生物質(zhì)能源開發(fā)利用，開展了秸稈氣化、固化，秸稈飼料和秸稈材料等多方面的研究[12-14]，玉米秸稈產(chǎn)業(yè)將成為推動非糧食生物質(zhì)能源開發(fā)利用和發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。

玉米秸稈含有35%～40%的纖維素，20%～25%的木質(zhì)素，20%左右的半纖維素，通過稀酸處理-酶耦聯(lián)水解將纖維、半纖維及多糖組分降解可發(fā)酵單糖，利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將其轉(zhuǎn)化為平臺化合物，具有產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景[15]。

本研究以玉米秸稈糖醇液為原料，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X-1為菌株，開展其菌株廣譜碳源同化能力、發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化及生物基丁二酸表征研究，為廉價玉米秸稈糖醇原料生產(chǎn)丁二酸和生物質(zhì)資源再利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）X-1（ATCC 55618），本實(shí)驗(yàn)室選育并保藏。

1.1.2 原料

玉米秸稈糖醇液（玉米秸稈酸-酶水解處理過程中加入生物化工醇釜底殘留物（含35%多糖組分）由長春大成新化工醇有限公司提供。經(jīng)高效液相色譜（Waters 410）分析玉米秸稈糖醇液中含葡萄糖50.83%、木糖31.37%、纖維二糖2.43%。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Waters 600高效液相色譜 美國Waters公司；Perkin Elmer Spectrum One傅里葉變換紅外光譜 美國PE公司；Avance 400核磁共振儀 瑞士Bruker公司；UV-5100紫外-可見光分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江新東方生物技術(shù)有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；PHS-3C酸度校準(zhǔn)儀上海雷磁分析儀器廠；DHP120恒溫培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；超凈工作臺 蘇州億誠潔凈技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丁二酸發(fā)酵工藝流程

菌株→活化→種子液→丁二酸發(fā)酵→丁二酸菌懸液→離心（8 000 r/min）→上清液活性碳脫色→過濾→上清液濃縮→低溫結(jié)晶（4 ℃）→丁二酸晶體

1.2.2 種子及發(fā)酵培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基配方（g/L）：葡萄糖2.5、胰蛋白胨17、大豆蛋白胨3、NaCl 5、K2HPO42.5，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L）：玉米秸稈糖20～60、NaCl 1、CaCl20.6、MgCl20.6、K2HPO43、酵母膏8，pH 7.0。

1.2.3 菌種培養(yǎng)與發(fā)酵條件

活化的斜面菌株進(jìn)行液體種子培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h。體積分?jǐn)?shù)10%種子液裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角搖瓶（容積為250 mL），置于37 ℃、通入CO2進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，發(fā)酵周期48 h。5 L發(fā)酵規(guī)模培養(yǎng)，玉米秸稈糖醇液3 L，營養(yǎng)鹽組成同上，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵周期48 h，攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min，通入100% CO2，通氣量為0.1 L/min。

1.2.4 酸結(jié)晶法提取丁二酸

發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min去除菌體，2 g/100 mL活性碳去除雜質(zhì)，HCl調(diào)pH值至2.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮丁二酸發(fā)酵液，4 ℃低溫結(jié)晶[16]。

1.2.5 丁二酸計(jì)算公式

式中：ρ1為初始還原糖質(zhì)量濃度/（g/L）；ρ2為殘?zhí)琴|(zhì)量濃度/（g/L）；ρ3為丁二酸質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體濃度的測定

菌體濁度（OD660nm）表示菌體生長狀況，取1 mL菌液，稀釋若干倍，用紫外-可見分光光度計(jì)于660 nm波長處測定光密度值[17]。

1.3.2 玉米秸稈糖醇液組分分析

Waters 410液相色譜儀，柱溫80 ℃，示差檢測器進(jìn)行檢測，BP-100Ca+色譜柱，采用面積歸一法分析玉米秸稈水解液糖組分。

1.3.3 丁二酸分析

高效液相色譜分析丁二酸，色譜柱為Waters C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流動相為5 mmol/L硫酸，pH 2.5，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min。利用Waters 2487紫外檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長為210 nm，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.3.4 丁二酸紅外光譜表征

丁二酸的紅外光譜分析應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜法，分辨率為4 cm－1，掃描范圍為4 000～450 cm－1，KBr壓片，KBr做背景掃描。測試前樣品在50 ℃條件下，干燥至恒質(zhì)量。

1.3.5 丁二酸核磁共振氫譜表征

以二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）為溶劑，采用核磁共振儀進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)琥珀酸放線桿菌廣譜碳源同化能力

圖1 產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X-1對不同碳源的同化能力Fig.1 The ability of A. succinogenes X-1 to assimilate different carbon sources

依據(jù)高效液相色譜分析玉米秸稈糖醇液中含有六碳糖、五碳糖和少量纖維二糖。分別以葡萄糖、木糖、纖維二糖和玉米秸稈糖醇液為碳源，考察產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X-1廣譜碳源同化能力。由圖1可知，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X-1能利用葡萄糖、木糖和纖維二糖，并可同化利用玉米秸稈糖醇液。提示此菌株具有廣譜碳源同化能力，經(jīng)戊糖磷酸途徑同化利用戊糖[18]。

2.2 玉米秸稈糖醇液還原糖質(zhì)量濃度對產(chǎn)丁二酸的影響

以玉米秸稈糖醇液為碳源，初始還原糖質(zhì)量濃度分別為20、30、40、50 g/L和60 g/L，探討產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X-1生長及生物轉(zhuǎn)化丁二酸影響。由圖2可知，玉米秸稈糖醇液初始還原糖質(zhì)量濃度從20 g/L增加到40 g/L時，丁二酸產(chǎn)量持續(xù)增加。當(dāng)還原糖質(zhì)量濃度為60 g/L時，發(fā)酵液中丁二酸產(chǎn)量開始下降，推測高質(zhì)量濃度還原糖抑制菌株的生長及發(fā)酵代謝產(chǎn)物合成。確定玉米秸稈糖醇液還原糖質(zhì)量濃度40 g/L，發(fā)酵48 h，丁二酸產(chǎn)量為17.9 g/L，丁二酸產(chǎn)率為72.8%。

圖2 還原糖質(zhì)量濃度對產(chǎn)丁二酸的影響Fig.2 Effect of initial reducing sugar concentration on the yield of succinic acid

2.3 氮源質(zhì)量濃度對產(chǎn)丁二酸的影響

酵母膏富含蛋白質(zhì)、氨基酸類、肽類、核苷酸、B族維生素和微量元素，其作用不僅提供微生物生長的氮源，而且有利微生物丁二酸代謝合成[19]。本實(shí)驗(yàn)以酵母膏為氮源，玉米秸稈糖醇液初始還原糖質(zhì)量濃度40 g/L條件下，考察不同質(zhì)量濃度酵母膏對產(chǎn)丁二酸的影響。由圖3可知，在適當(dāng)?shù)奶嫉葪l件下，隨著產(chǎn)琥珀酸放線桿菌生長，丁二酸產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度過高，菌體增長減緩，胞外代謝產(chǎn)物丁二酸生成降低。酵母膏質(zhì)量濃度12 g/L（碳氮比為24.7）時，丁二酸產(chǎn)量為23.9 g/L，丁二酸產(chǎn)率為79.1%，還原糖利用率為75.5%。

圖3 酵母膏質(zhì)量濃度對產(chǎn)丁二酸的影響Fig.3 Effect of yeast extract concentration on the yield of succinic acid

2.4 MgCO3質(zhì)量濃度對產(chǎn)丁二酸的影響

丁二酸發(fā)酵過程中，胞外代謝產(chǎn)物有機(jī)酸的積累會導(dǎo)致培養(yǎng)基質(zhì)中pH值變化，以MgCO3為緩沖劑，在玉米秸稈糖醇液還原糖質(zhì)量濃度40 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度12 g/L，發(fā)酵周期48 h條件下，探討不同MgCO3質(zhì)量濃度對產(chǎn)丁二酸的影響。由圖4可知，MgCO3質(zhì)量濃度5～15 g/L時，丁二酸產(chǎn)量逐漸增加，MgCO3質(zhì)量濃度超過15 g/L，丁二酸產(chǎn)量變化較小。其機(jī)理為MgCO3在發(fā)酵過程中分解生成CO2，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X-1，經(jīng)PEP羧化激酶途徑固定CO2并生成丁二酸。最適MgCO3質(zhì)量濃度為15 g/L，丁二酸產(chǎn)量29.0 g/L，丁二酸產(chǎn)率為83.6%，還原糖利用率為86.7%。

圖4 MgCO3質(zhì)量濃度對產(chǎn)丁二酸的影響Fig.4 Effect of MgCO3concentration on the yield of succinic acid

2.5 中心組合試驗(yàn)確定因素最佳水平

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table1 Box-Behnken experimental design and results

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，選定還原糖質(zhì)量濃度（A）、酵母膏質(zhì)量濃度（B）和MgCO3質(zhì)量濃度（C）為變量，各選取3 個水平，試驗(yàn)因素編碼及水平如表1所示。根據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)軟件設(shè)計(jì)三因素三水平共17 個試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。17 個試驗(yàn)點(diǎn)分為兩類，一類是析因點(diǎn)，共12 個；一類是零點(diǎn)為區(qū)域中心點(diǎn)。零點(diǎn)重復(fù)5 次，用于估計(jì)試驗(yàn)的誤差。

根據(jù)表1試驗(yàn)結(jié)果，以丁二酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，根據(jù)試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可得方程：Y=29.20+1.99A+1.74B+1.38C+0.27AB+ 0.75AC+0.15BC－3.94A2－3.49B2－4.56C2。決定系數(shù)R2=0.931 1，說明方程的擬合度很好，可以用該回歸方程替代真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.5.2 方差分析

回歸方程的方差分析結(jié)果（表2）表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對響應(yīng)值的影響是高度顯著的，交互項(xiàng)的影響不明顯，試驗(yàn)因子與響應(yīng)值之間不是線性關(guān)系。方差分析結(jié)果還表明，“模型＞F”＜0.000 1遠(yuǎn)小于0.05，說明模型是顯著的[20]。一般認(rèn)為決定系數(shù)R2大于0.9，表明預(yù)測值能與實(shí)驗(yàn)值具有高度相關(guān)性。在本實(shí)驗(yàn)中，R2=0.931 1，表明僅有不到7%的丁二酸產(chǎn)量變異不能由該模型解釋。

表2 回歸模型方差分析Table2 Analysis of variance for the regression model

通過多元回歸方程的響應(yīng)面曲線圖（圖5）分析可知，回歸模型存在最大穩(wěn)定點(diǎn)。丁二酸產(chǎn)量（Y）的最大估計(jì)值為29.8 g/L，最佳點(diǎn)為A=42.81、B=12.53、C= 15.90，即還原糖質(zhì)量濃度為42.81 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度為12.53 g/L、MgCO3質(zhì)量濃度為15.90 g/L，此點(diǎn)丁二酸產(chǎn)量為29.8 g/L。

圖5 各因素交互作用對產(chǎn)丁二酸影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for succinic acid production

2.6 發(fā)酵穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對最佳點(diǎn)進(jìn)行3 批次5 L發(fā)酵規(guī)模穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，每間隔4 h取樣，發(fā)酵過程對菌體生物量、還原糖質(zhì)量濃度以及丁二酸積累進(jìn)行全分析，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X-1發(fā)酵結(jié)果（圖6），發(fā)酵周期48 h時，丁二酸含量29.1 g/L，還原糖利用率為85.5%，丁二酸產(chǎn)率85.1%，表明預(yù)測值與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)很接近，說明回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各因素對丁二酸發(fā)酵影響。

圖6 5 L發(fā)酵規(guī)模實(shí)驗(yàn)Fig.6 Temporal curves for succinic acid production and reducing sugar consumption during fementation in a 5-L fermentor

2.7 生物基丁二酸結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜可根據(jù)分子內(nèi)部原子間的相對振動和分子轉(zhuǎn)動等信息確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)并鑒定其化合物。由圖7可知，2 400～3 300 cm－1處有寬吸收帶，1 419 cm－1處有較強(qiáng)吸收， 說明存在—COOH，1 694 cm－1處為C=O伸縮振動吸收，1 207 cm－1和1 310 cm－1處分別為C—O伸縮振動和O—H 面內(nèi)變形振動吸收，1 630～1 680 cm－1處沒有吸收，提示不存在C=C鍵，與色譜純丁二酸標(biāo)樣吸收峰吻合，發(fā)酵產(chǎn)物為生物基丁二酸。

圖7 丁二酸紅外光譜Fig.7 IR spectrum of succinic acid

圖8 純化后生物基丁二酸樣品核磁共振氫譜Fig.8 1H NMR spectrum of the purified bio-based succinic acid

圖8氫的核磁共振譜圖提供了化學(xué)位移、偶合常數(shù)、積分曲線，由此可以推測質(zhì)子在碳原子上的位置。以DMSO為溶劑，其中化學(xué)位移2.50處的吸收峰為溶劑峰，丁二酸的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)采用文獻(xiàn)[21]所述化學(xué)位移值，化學(xué)位移12.11為—COOH上的1H譜峰，化學(xué)位移2.41為—CH2—上的1H譜峰，峰面積比約為1∶2，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)酵產(chǎn)物為生物基丁二酸。且雜峰較少，提示酸結(jié)晶法提取生物基丁二酸純度較高。

3 結(jié) 論

利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，通過中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化丁二酸發(fā)酵工藝，確定發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為：玉米秸稈糖醇液還原糖質(zhì)量濃度42.81 g/L、酵母膏質(zhì)量濃度12.53 g/L、MgCO3質(zhì)量濃度15.90 g/L。經(jīng)5 L發(fā)酵規(guī)模實(shí)驗(yàn)，厭氧發(fā)酵48 h時，還原糖的利用率為85.4%，丁二酸產(chǎn)率為85.1%。

酸結(jié)晶法提取丁二酸，經(jīng)紅外和核磁共振表征，驗(yàn)證發(fā)酵產(chǎn)物為生物基丁二酸。為綜合利用生物化工醇企業(yè)玉米秸稈糖醇產(chǎn)丁二酸，延長發(fā)酵產(chǎn)業(yè)鏈，增加副產(chǎn)物附加值，提供可行性研究。

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Fermentation and Characterization of Succinic Acid from Sugar-Alcohol Solution of Corn Stover

YE Xiao-jin, WANG Hong-lei, WANG Xiao-jun, XU Hong-zhang, XUE Dong-hua*
(School of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China)

In this work, the sugar-alcohol solution of corn stover was fermented to produce succinic acid. The carbon assimilation ability of Actinobacillus succinogenes X-1 was investigated using different carbon sources and the strain was verified to be able to assimilate the sugar-alcohol solution to produce succinic acid. A Box-Behnken design was used to optimize three medium components by response surface methodology. The optimum medium was obtained by adding 12.53 g/L yeast extract as a nitrogen source, and 15.90 g/L MgCO3as a pH buffer to the sugar-alcohol solution containing 42.81 g/L reducing sugar. After 48 h of fermentation in a 5-L fermentor, the yield of succinic acid was 85.1% and the utilization rate of reducing sugar was 85.4%. The crystal of the fermentation product was obtained by acidic crystallization and succinic acid was characterized using infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance.

succinic acid; fermentation; sugar-alcohol solution of corn stover; Actinobacillus succinogenes

TQ921.7

A

1002-6630（2014）23-0161-05

10.7506/spkx1002-6630-201423032

2013-12-31

“十二五”吉林省教育廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（201192）；長春市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012213）

葉小金（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：yexiaojin88@126.com

*通信作者：薛冬樺（1957—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：xuedonghua@mail.ccut.edu.cn