雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD cDNA基因的克隆及序列分析

岳宗豪，樊鑫，趙歡，任洪偉，張旭峰，周一兵

(大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連 116023）

雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD cDNA基因的克隆及序列分析

岳宗豪，樊鑫，趙歡，任洪偉，張旭峰，周一兵

(大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連 116023）

根據(jù)已知多毛類Alitta succinea銅鋅超氧化物歧化酶 (Cu/Zn－SOD）基因序列設計引物，利用同源克隆及RACE方法首次從雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn－SOD基因全長cDNA序列。結果表明:雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因cDNA全長870 bp，其中包括156 bp的5'端非編碼區(qū)，261 bp 3'端非翻譯區(qū)和453 bp開放閱讀框，編碼150個氨基酸;該蛋白序列具有典型的Cu2+和Zn2+結合位點，并具有兩處Cu/Zn－SOD蛋白家族標簽序列。通過生物信息學分析表明，該蛋白屬于胞內Cu/Zn－SOD，理論相對分子質量為15 249 900，等電點為5.66，無信號肽和跨膜區(qū)，推測為親水性蛋白。同源性分析表明，雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD氨基酸序列與部分軟體動物、魚類和昆蟲的Cu/Zn－SOD蛋白序列具有很高的相似性。該研究結果為后續(xù)研究Cu/Zn－SOD與環(huán)境污染物之間的劑量效應關系奠定了基礎，為研究雙齒圍沙蠶機體的防御機制提供了基礎資料。

雙齒圍沙蠶;銅鋅超氧化物歧化酶;生物信息學分析;同源性分析

銅鋅超氧化物歧化酶 (copper－zinc superoxide dismutase，Cu/Zn－SOD）屬于超氧化物歧化酶家族，廣泛存在于真核和原核生物中。Cu/Zn－SOD一般是由2個基本相似的亞基組成的二聚體，且每個亞基含有1個銅原子和1個鋅原子［1］。其中銅與催化活性有關，銅的缺失將會導致其活性完全喪失，進而危害人類和動物體的健康，產生多種疾病［2－5］。Cu/Zn－SOD的主要功能是清除體內多余的超氧陰離子自由基，保護機體免受氧化損傷。由于Cu/Zn－SOD的存在，健康水生動物體內的活性氧自由基能夠維持在有利無害的較低水平［6］。此外，Cu/Zn－SOD還與免疫有關。Sook等［7］研究發(fā)現(xiàn)，注射脂多糖的螃蟹Callinectes sapidus體內Cu/Zn－SOD被顯著誘導，表明Cu/Zn－SOD與免疫防御系統(tǒng)有關。Bao等［8］研究發(fā)現(xiàn)，對海灣扇貝Argopecten irradians注射鰻弧菌后，其血細胞中Cu/Zn－SOD表達水平增加，表明Cu/Zn－SOD在對鰻弧菌的免疫反應中可能起著重要作用。

雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis隸屬于環(huán)節(jié)動物門Annelida、多毛綱Polychaeta，是廣泛分布于中國沿海潮間帶及河口潮灘的優(yōu)勢底棲動物，屬于重要的經濟多毛類［9］。由于其生活在極易富集污染物的沉積質中，更容易受到污染物的影響，所以雙齒圍沙蠶常作為污染物暴露的指示生物。目前，已經在軟體動物［10－12］、節(jié)肢動物［13－14］、脊索動物［15－16］等中獲得了 Cu/Zn－SOD 序列，但有關雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD序列的研究國內外尚未見報道。

從分子水平深入開展沙蠶Cu/Zn－SOD基因克隆研究，有助于探索污染物在沙蠶體內的代謝途徑及其解毒機理，并為進一步研究雙齒圍沙蠶的生態(tài)毒理學提供基礎依據(jù)和新思路。本研究中，利用同源克隆及RACE方法首次從雙齒圍沙蠶體壁組織中克隆得到Cu/Zn－SOD基因，并對該基因進行了生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雙齒圍沙蠶采自遼寧省盤錦市雙臺子河口，挑選體質量為1.5～2.5 g的個體，帶回遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間，每24 h更換一次海水，水溫保持在 (19±0.5）℃，鹽度為31～32，pH為8.25±0.10。試驗海水中 Cu(Ⅱ）、Hg(Ⅱ）、Zn(Ⅱ）、Pb(Ⅱ）和Cd(Ⅱ）的背景濃度分別為0.38、0.01、75.00、0.27、0.06 μg/L。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 剪取0.1 g雙齒圍沙蠶體壁放入預冷滅菌研缽中，加入液氮將組織迅速研磨至粉末狀，按照RNAisoTMPlus(TaKaRa公司）說明書中的相關步驟提取總RNA。將提取的總RNA溶于DEPC處理水中，于－80℃下保存?zhèn)溆?。?0 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，使用超微量分光光度計測定其濃度。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 以提取的雙齒圍沙蠶總RNA為模板，按照Reverse Transcriptase MMLV(RNase Hˉ）反轉錄試劑盒 (TaKaRa公司）說明書進行第一鏈的合成。cDNA第一鏈合成反應條件如下:70℃下反應10 min，放到冰上急冷2 min，然后在42℃下反應60 min，70℃下反應15 min。

1.2.3 引物設計 依據(jù)已知多毛類Alitta succineaCu/Zn－SOD基因 (HM563679.1）CDS保守區(qū)設計簡并引物，利用同源克隆獲得雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因的特異性片斷。根據(jù)得到的Cu/Zn－SOD特異性片段設計3'RACE和5'RACE引物。UPM由Clontech SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒提供，其余引物利用Primer 5.0軟件設計，由TaKaRa公司合成。本試驗中所用引物見表1。

1.2.4 特異性片段擴增 按照TaKaRa Ex Taq?Hot Start Version試劑盒說明書，利用設計的簡并引物進行特異性片段的擴增。特異性片段PCR反應體系共 25 μL，包含:TaKaRa Ex Taq(5 U/μL）0.2 μL，10 × Ex PCR Buffer(Mg2+plus）2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L）2.0 μL，引物各 0.5 μL，模板 2.0 μL，ddH2O 17.3 μL。反應條件如下:94℃下預變性2 min;94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進行35個循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min。取4.0 μL PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用TIANgel Midi Purification Kit切膠回收試劑盒切膠回收目的條帶?；厥蘸蟮漠a物連接到pMDTM18－T Vector(TaKaRa公司）載體上，連接產物熱轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，然后涂布于含有Amp(Ampicillin）的LB平板培養(yǎng)基上，37℃下倒置培養(yǎng)12～16 h。挑選獨立的較大白色單菌落至LB液體培養(yǎng)基 (含Amp）中，于37℃下培養(yǎng)4 h，取1.0 μL菌液進行菌落PCR檢測，選取陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。

表1 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因全長擴增引物Tab.1 The primers used in the amplication of Cu/Zn－SOD in sandworm Perinereis aibuhitensis

1.2.5 RACE擴增 按照Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進行3'RACE和5'RACE擴增。3'RACE和5'RACE PCR反應體系共50 μL，包含:10 ×Adantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，50 × Adantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，3'RACE －Ready cDNA(或5'RACE －Ready cDNA）2.5 μL，3'RACE(或5'RACE）引物 1.0 μL，10 × UPM Mix 5.0 μL，ddH2O 34.5 μL。反應條件如下:94℃下變性30 s，72℃下延伸3 min，共進行5個循環(huán);94℃下變性30 s，70℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進行5個循環(huán);94℃下變性30 s，68℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進行25個循環(huán)。取4.0 μL PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用“1.2.4”節(jié)的方法進行切膠回收和轉化連接。挑取陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。利用DNAStar軟件對中間片段、3'RACE和5'RACE測序結果進行拼接。

1.2.6 序列分析 應用DNAStar軟件查找雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因開放閱讀框 (ORF），并將其翻譯成氨基酸序列;利用Conserved Domains軟件預測氨基酸序列保守區(qū)域，使用ScanProsite軟件分析氨基酸序列的潛在修飾位點，使用ProtParam工具預測氨基酸序列的理化性質，使用PSORTⅡ軟件進行細胞內定位預測，使用Signal P Server軟件進行信號肽預測，使用TMHMM軟件進行跨膜區(qū)分析，使用ProtScale工具進行疏水性分析，使用SOPMA軟件和SWISS－MODEL軟件分別預測氨基酸序列的二級和三級結構;使用Clustal 2.1進行雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD多重序列比對，使用Mega 5.0軟件構建同源關系進化樹，自展檢測重復為1000次。

2 結果與分析

2.1 特異性片段擴增及RACE擴增

依據(jù)已知多毛類Alitta succineaCDS保守區(qū)設計簡并引物，同源克隆得到326 bp的特異性片段。3'RACE擴增獲得一條512 bp的條帶，5'RACE PCR產物經切膠回收測序為453 bp。使用DNAStar軟件進行序列拼接，得到870 bp的雙齒圍沙蠶cDNA全序列，提交至 GenBank，登錄號為KF199864。

圖1 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD特異性片段擴增及RACE擴增結果Fig.1 RACE amplification product of Cu/Zn－SOD fragment from sandworm Perinereis aibuhitensis

2.2 生物信息學分析

2.2.1 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基本理化信息分析 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD cDNA基因全長870 bp，其中5'端非翻譯區(qū) (5'UTR）為156 bp，3'端非翻譯區(qū) (3'UTR）為261 bp，開放閱讀框(ORF）為453 bp，編碼一個由150個氨基酸組成的蛋白質 (圖2）。使用ProtParam工具推測Cu/Zn－SOD氨基酸序列分子式為C655H1043N195O217S4，原子數(shù)為2114，理論相對分子質量為15 249 900，等電點為5.66，氨基酸序列中帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu）17個，占11.33%，帶正電荷的氨基酸 (Arg+Lys）11個，占7.33%。根據(jù)ProtScale預測結果，Cu/Zn－SOD氨基酸疏水性最大值為2.200，最小值為－2.644，整個多肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，推斷該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD亞細胞定位分析預測結果顯示，該蛋白位于細胞質中的可能性為65.2%，位于細胞核內的可能性為21.7%，在其他細胞器中的可能性較小。對Cu/Zn－SOD蛋白進行信號肽的預測，未發(fā)現(xiàn)明顯的信號肽位點，也未發(fā)現(xiàn)該蛋白有跨膜區(qū)，表明Cu/Zn－SOD蛋白既不是跨膜蛋白也不是分泌蛋白。

2.2.3 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD功能區(qū)預測 通過Conserved Domains預測氨基酸序列保守區(qū)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有典型的Cu2+結合位點 His－43、His－45、His－59和His－117，以及Zn2+結合位點His－59、His－68、His－77和 Asp－80(圖 2）。此外，該氨基酸序列還含有兩處 Cu/Zn－SOD蛋白家族標簽序列:GFHVHQFGDNT(41～51）和GNAGGRLACGVI(135～146）(圖2）。

2.2.4 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD二級和三級結構預測 對雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因編碼的蛋白二級結構進行預測，結果顯示:α－螺旋 (Alpha helix）占整個蛋白質的4.67%，無規(guī)則卷曲(Random coil）占54.67%，延伸鏈 (Extended strand）占32.00%，而β－轉角 (Beta turn）占8.67%。Cu/Zn－SOD三級結構預測結果見圖3。

2.2.5 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD同源序列比對及系統(tǒng)進化分析 同源性比較結果表明，雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD與琥珀刺沙蠶Alitta succinea同源性最高，達79%，與部分軟體動物、魚類和昆蟲也具有較高的同源性，同源性為71%～78%。其中與太平洋牡蠣Crassostrea gigas同源性為78%，與日本盤鮑Haliotis discus discus同源性為76%，與龐貝蠕蟲Alvinella pompejana同源性為75%，與日本鰻鱺Anguilla japonica同源性為72%，與煙粉虱Bemisia tabaci同源性為71%(圖4）。系統(tǒng)進化分析結果表明，雙齒圍沙蠶和琥珀刺沙蠶首先聚為一簇，表明其親緣關系較近 (圖5）。

3 討論

圖2 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD cDNA基因序列及推導的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of Cu/Zn－SOD cDNA in sandworm Perinereis aibuhitensis

圖3 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD三級結構預測圖Fig.3 Predication of the tertiary structure of Cu/Zn SOD from sandworm Perinereis aibuhitensis

圖4 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD的氨基酸序列與其他物種蛋白氨基酸序列的比對Fig.4 Comparison of deduced amino acid sequence alignment of Cu/Zn－SOD in the sandworm with that in the other species

圖5 雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Cu/Zn－SOD from sandworm Perinereis aibuhitensis

本研究中，首次報道了雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因的cDNA序列全長。序列分析結果顯示，雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD cDNA全長870 bp，包括156 bp的5'端非翻譯區(qū)，261 bp的3'端非翻譯區(qū)和453 bp的閱讀框，編碼150個氨基酸。Rhee等［17］克隆并分析琥珀刺沙蠶Cu/Zn－SOD序列時發(fā)現(xiàn)，該序列包含4個Cu2+結合位點 (His－45、His－47、His－62和 His－119）和4個 Zn2+結合位點 (His－62、His－70、His－79和 Asp－82），同時還具有兩個Cu/Zn－SOD特征序列 (GFHVHEFGDNT、GNAGGRLACGVI）。Wang 等［18］在紫貽貝Mytilus galloprovincialisCu/Zn－SOD蛋白序列中也發(fā)現(xiàn)，具有Cu2+、Zn2+結合位點和特征序列。本研究中，在獲得的雙齒圍沙蠶SOD序列中亦發(fā)現(xiàn)了4個Cu2+結合位點 (His－43、His－45、His－59和His－117）和4個 Zn2+結合位點 (His－59、His－68、His－77和 Asp－80），并確定具有兩處Cu/Zn－SOD蛋白家族標簽序列 (41～51，135～146）。因此，推斷該序列為雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD序列。此外，Cu/Zn－SOD氨基酸序列具有色氨酸和酪氨酸缺乏，甘氨酸含量較高的特點［19－20］。對獲得的序列進行分析發(fā)現(xiàn)，不存在色氨酸和酪氨酸，而甘氨酸的比例達到16.7%，這進一步表明獲得的序列為雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD。

生物體內含有胞外和胞內兩種Cu/Zn－SOD序列，其中胞外Cu/Zn－SOD通常含176～251個氨基酸殘基，N端具有信號肽序列;而胞內Cu/Zn－SOD含147～167個氨基酸殘基，N端無信號肽序列［21－22］。本研究中獲得的雙齒圍沙蠶 Cu/Zn －SOD蛋白質序列包含150個氨基酸，且N端無信號肽，細胞定位預測其存在于細胞質中的可能性為65.2%，故推測其為胞內Cu/Zn－SOD序列。

多序列同源比對分析結果，通過NJ法進行系統(tǒng)進化樹分析。結果顯示，多毛類雙齒圍沙蠶和琥珀刺沙蠶首先聚為一簇，然后與東方螻蛄、肩突硬蜱、桔小實蠅等昆蟲綱聚為一簇，再與軟體動物、脊椎動物哺乳類和魚類聚在一起。這說明Cu/Zn－SOD基因在物種中具有高度保守性，并且在一定程度上是按照該基因所屬物種的進化而進化的。但是，姜冰等［6］和朱丹等［23］的研究表明，Cu/Zn－SOD的系統(tǒng)進化并不嚴格按照該基因所屬物種的進化而進化。這可能是由于物種差異造成的，有的物種中Cu/Zn－SOD是以物種進化而進化的，而有的則不是。

趙雙菁等［24］研究表明，2.000 ～ 8.653 μL/L Pb2+能夠上調水絲蚓Limnodilus claparedianuSOD酶活性，12.481 μL/L Pb2+則顯著抑制 SOD酶活性。據(jù)Kim 等［25］報道，1 μg/L 4－ 壬基酚 (4－NP）能夠上調日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicusCu/Zn－SOD和 Mn－SOD mRNA的表達。鑒于SOD對環(huán)境污染物的敏感性，利用SOD作為分子生物標記已經成為了近年來的研究熱點。雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因的克隆目前尚屬首次，雙齒圍沙蠶Cu/Zn－SOD基因的獲得及對該序列的分析，為研究其體內免疫和機體防御機制提供了基礎資料，也為Cu/Zn－SOD作為生物標志物指示和監(jiān)測環(huán)境污染奠定了基礎。

［1］ 張立穎，趙萌，王躍智.水生生物超氧化物岐化酶的研究進展［J］.江西農業(yè)大學學報，2012，34(4）:800 －804.

［2］ Mavelli I，Ciriolo M R，Rossi L，et al.Favism:a haemolytic disease associated with increased superoxide dismutase and decreased glutathione peroxidase activities in red blood cells［J］.European Journal of Biochemistry，1984，139(1）:13 －18.

［3］ Brown D R，Schmidt B，Groschup M H，et al.Prion protein expression in muscle cells and toxicity of a prion protein fragment［J］.European Journal of Cell Biology，1998，75(1）:29 －37.

［4］ Noor R，Mittal S，Iqbal J.Superoxide dismutase － applications and relevance to human diseases［J］.Medical Science Monitor，2002，8(9）:210－215.

［5］ Anju A，Jeswin J，Thomas P C，et al.Molecular cloning，characterization and expression analysis of cytoplasmic Cu/Zn－superoxide dismutase(SOD）from pearl oyster Pinctada fucata［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2013，34(3）:946 －950.

［6］ 姜冰，鮑相渤，張明，等.蝦夷扇貝銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆與轉錄表達特性分析［J］.生物技術通報，2011，12:150－156.

［7］ Sook Chung J，Bachvaroff T R，Trant J，et al.A second copper zinc superoxide dismutase(CuZnSOD）in the blue crab Callinectes sapidus:cloning and up－regulated expression in the hemocytes after immune challenge［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2012，32(1）:16－25.

［8］ Bao Y，Li L，Wu Q，et al.Cloning，characterization，and expression analysis of extracellular copper/zinc superoxide dismutase gene from bay scallop Argopecten irradians［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2009，27(1）:17 －25.

［9］ 李穎，周一兵，萬良，等.雙齒圍沙蠶Hsp70 cDNA基因的克隆及序列分析［J］.大連海洋大學學報，2012，27(6）:502 －507.

［10］ Kim K Y，Lee S Y，Cho Y S，et al.Molecular characterization and mRNA expression during metal exposure and thermal stress of copper/zinc－and manganese superoxide dismutases in disk abalone，Haliotis discus discus［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2007，23(5）:1043 －1059.

［11］ Zhang G，F(xiàn)ang X，Guo X，et al.The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation［J］.Nature，2012，490:49－54.

［12］ Ni D，Song L，Gao Q，et al.The cDNA cloning and mRNA expression of cytoplasmic Cu，Zn superoxide dismutase(SOD）gene in scallop Chlamys farreri［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2007，23(5）:1032－1042.

［13］ Lyu K，Zhu X，Wang Q，et al.Copper/Zinc superoxide dismutase from the cladoceran Daphnia magna:molecular cloning and expression in response to different acute environmental stressors［J］.Environmental Science ＆ Technology，2013，47(15）:8887－8893.

［14］ Cheng W，Tung Y H，Liu C H，et al.Molecular cloning and characterisation of copper/zinc superoxide dismutase(Cu，Zn － SOD）from the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2012，21(1）:102 －112.

［15］ Zhang Z W，Li Z，Liang H W，et al.Molecular cloning and differential expression patterns of copper/zinc superoxide dismutase and manganese superoxide dismutase in Hypophthalmichthys molitrix［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2011，30(2）:473 －479.

［16］ Chakravarthy N，Aravindan K，Kalaimani N，et al.Intracellular copper zinc superoxide dismutase(icCuZnSOD）from Asian seabass(Lates calcarifer）:molecular cloning，characterization and gene expression with reference to Vibrio anguillarum infection［J］.Developmental ＆ Comparative Immunology，2012，36(4）:751－755.

［17］ Rhee J S，Won E J，Kim R O，et al.Expression of superoxide dismutase(SOD）genes from the copper－ exposed polychaete，Neanthes succinea［J］.Marine Pollution Bulletin，2011，63(5/12）:277－286.

［18］ Wang Q，Yuan Z Y，Wu H F，et al.Molecular characterization of a manganese superoxide dismutase and copper/zinc superoxide dismutase from the musselMytilus galloprovincialis［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2013，34(5）:1345 －1351.

［19］ 包永波.海灣扇貝超氧化物歧化酶家族基因結構表達和多態(tài)性分析［D］.青島:中國科學院海洋研究所，2009.

［20］ 田春美，鐘秋平.超氧化物歧化酶的現(xiàn)狀研究進展［J］.中國熱帶醫(yī)學，2005，5(8）:1730 －1732.

［21］ Lin Y C，Vaseeharan B，Chen J C.Identification of the extracellular copper－zinc superoxide dismutase(ecCuZnSOD）gene of the mud crab Scylla serrata and its expression following β－glucan and peptidoglycan injections［J］.Molecular Immunology，2008，45(5）:1346－1355.

［22］ Parker J D，Parker K M，Keller L.Molecular phylogenetic evidence for an extracellular Cu Zn superoxide dismutase gene in insects［J］.Insect Molecular Biology，2004，13(6）:587 －594.

［23］ 朱丹，李宏俊，高祥剛，等.文蛤胞內銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆與序列分析［J］.生物技術通報，2010(11）:123－128.

［24］ 趙雙菁，李艷秋，柳郁濱，等.Pb2+對水絲蚓的急性毒性及超氧化物歧化酶活性的影響［J］.中國農學通報，2012，28(8）:87－89.

［25］ Kim B M，Rhee J S，Park G S，et al.Cu/Zn － and Mn －superoxide dismutase(SOD）from the copepod Tigriopus japonicus:molecular cloning and expression in response to environmental pollutants［J］.Chemosphere，2011，84(10）:1467 －1475.

Cloning and sequence analysis of Cu/Zn－SOD cDNA from sandworm Perinereis aibuhitensis

YUE Zong－h(huán)ao，F(xiàn)AN Xin，ZHAO Huan，REN Hong－wei，ZHANG Xu－feng，ZHOU Yi－bing
(Key Laboratory of Marine Bio－resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

A full length cDNA of Cu/Zn－SOD was firstly cloned in sandwormPerinereis aibuhitensisby homology cloning and RACE techniques based on the partial copper－zinc superoxide dismutase(Cu/Zn－SOD）gene from polychaeteAlitta succinea.The full length of the cDNA was found to be 870 bp including a 156 bp 5'untranslated region，a 261 bp 3'untranslated region and 453 bp open reading frame encoding 150 amino acids.There were typical Cu2+and Zn2+binding sites as well as two Cu/Zn－SOD protein family tag sequences in the deduced protein which was within the intracellular Cu/Zn－SOD with relative molecular mass of 15 249 900 and the isoelectric point of 5.66 by bioinformatic analysis.No signal peptide and transmembrane domain were observed in the deduced protein，indicating that it belonged to the hydrophilic protein.Multiple sequences alignment analysis revealed that the deduced amino acids had high homology to the proteins of partial molluscs，fishes and insects.The findings will provide basis for research of dose－response between gene expression and environmental pollutants，and defense mechanism of the sandworm.

Perinereis aibuhitensis;Cu/Zn－SOD;bioinformatic analysis;homology analysis

Q78;S917

A

10.3969/J.ISSN.2095－1388.2014.04.006

2095－1388(2014）04－0354－06

2013－12－03

國家海洋公益性行業(yè)科研專項 (201305002，201305043）;國家海洋局重點實驗室開放基金資助項目 (201217）;國家自然科學基金資助項目 (41306138）

岳宗豪 (1989—），男，碩士研究生。E－mail:yzh642324521@163.com

周一兵 (1957—），男，教授。E－mail:ybzhou@dlou.edu.cn