副結(jié)核分歧桿菌IS900基因的檢測方法

郭瑩瑩 陳關(guān)勇 馬世福 （黑龍江省前進農(nóng)場畜牧科 黑龍江佳木斯 156331）

副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性消耗性傳染病，該病對奶牛業(yè)和肉牛業(yè)發(fā)達的國家造成巨大損失。目前尚無有效的治療方法，只能及時檢出，隔離，淘汰病畜。依據(jù)IS900為副結(jié)核特有的插入序列，其拷貝數(shù)高達20這一特點，以其副結(jié)核C-2株染色體脫氧核糖核酸（DNA）為模板，設(shè)計特異性引物，建立IS900基因的PCR擴增。將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，在電泳圖上，出現(xiàn)與目的基因等長的DNA帶。這種方法對于快速準(zhǔn)確的確診副結(jié)核病，具有重要的意義。

1 病原

副結(jié)核分枝桿菌又稱禽分枝桿菌副結(jié)核亞種，是引起副結(jié)核病的病原。副結(jié)核分枝桿菌主要感染牛羊等反芻動物，在原生動物負(fù)鼠，野兔，野生貓，野豬，赤鹿，野牛等動物體內(nèi)也可分離出該菌，甚至在食肉鳥類，靈長類動物及人體中也發(fā)現(xiàn)其存在。被感染的動物表現(xiàn)為頑固性腹瀉，呈間歇性或周期性，嚴(yán)重者糞便如水樣，噴射狀排出或稀粥樣，惡臭，含有蛋白凝塊，氣泡和大量粘液。隨著腹瀉癥狀的延續(xù)，病畜出現(xiàn)貧血，進行性消瘦。許多牛在發(fā)病后，高度渴感而大量飲水，下頜間隙和胸部等處出現(xiàn)不同程度的浮腫，腫脹面積大小不一。剖檢發(fā)現(xiàn)，小腸末端出現(xiàn)廣泛的肉芽腫。取病料后鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性的短桿菌，抗酸性染色陽性，為紅色成叢或成堆的兩端鈍圓的中小桿菌。副結(jié)核病的潛伏期長，病程緩慢，雖然年發(fā)病率僅為1%～2%，但感染率極高。

2 PCR的原理

PCR技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來，又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外擴增DNA的途徑之一。他主要通過選擇目的基因后，設(shè)計特異性的引物，在DNA聚合酶，脫氧核苷三磷酸（dNTP）的作用下“變性-退火-延伸”循環(huán)若干次，繼而達到在幾小時內(nèi)將目的基因擴增到幾十萬倍甚至幾百萬倍的目的。變性，即將模板DNA加熱至93℃左右后，模板DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)打開，成為單鏈，為與引物結(jié)合做好準(zhǔn)備。退火，即模板DNA變成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板單鏈的互補序列配對結(jié)合，然后DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下以寡核苷酸為反應(yīng)原料，以靶序列為模板，按堿基互補配對和半保留復(fù)制原理合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

副結(jié)核分枝桿菌有19個不同的插入序列，每個插入序列有其獨特的拷貝數(shù)。IS900一般為14～20個拷貝，其長度為1451 bp（注：bp表示堿基數(shù)量），G+C含量為66%，IS1311有7個拷貝，ISMav2有3個拷貝，f57有一個拷貝，Locus255有一個拷貝。本文將擴增副結(jié)核的插入序列IS900基因的片段。

3 實驗材料及方法

菌株為副結(jié)核分枝桿菌C-2株。試劑包括dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）、瓊脂糖、TE、溴化乙錠、溴酚藍。儀器與設(shè)備包括PCR儀、電泳槽、微波爐、微型離心機、移液器、電子天平。

PCR引物的設(shè)計：以副結(jié)核特有的IS900序列（Gene Bank Accession No.為S74401）為模板設(shè)計特異性引物，P1：5'CGGCACGGCTCTTGTTGT 3'；P2：5'TGGTCGTCTGCTGGGTTGA 3'。兩引物的間距為577bp。

PCR擴增的反應(yīng)條件。在離心管中加入下列擴增反應(yīng)液：菌體DNA模板1.5微升，上下游引物各0.5微升，Taq DNA聚合酶0.5微升，10×buffer 2.5微升，dNTP2微升，加滅菌水17.5微升，反應(yīng)總體積為25微升。瞬時離心，把管壁上的液體甩下去。將離心管放入PCR儀中。98℃預(yù)變性8分鐘后，按下列溫度進行30個循環(huán)：99℃變性1分鐘，55℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸1分鐘。

用電子天平稱取1克瓊脂糖倒入錐形瓶中，加入100毫升TE，配成濃度為1%的瓊脂糖凝膠溶液。再向溶液中加入6～7微升的溴化乙錠。稍涼后，倒入瓊脂糖凝膠板中，待其凝固后備用。瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增產(chǎn)物進行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將瓊脂板放在紫外投影儀下觀察，記錄實驗結(jié)果。

4 結(jié)果與討論

在電泳圖譜上可見兩條很亮的DNA帶位于約分子質(zhì)量標(biāo)記中500～750bp之間，由于設(shè)計的兩個引物之間的間距為577bp，由此可以看出已經(jīng)成功的擴增出IS900的基因片段。（見圖1）

本次實驗通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，再結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功的擴增了副結(jié)核分枝桿菌的插入序列—IS900基因片段，得到與目的基因大小相同的DNA帶，使體外擴增特異性基因成為可能。這可以做為副結(jié)核病診斷的現(xiàn)實基礎(chǔ)，為快速準(zhǔn)確的檢出副結(jié)核病畜及未發(fā)病的帶菌畜提供依據(jù)。隨著牛奶檢測要求和進口牛數(shù)日益增加，副結(jié)核病的檢測日益受到人們的關(guān)注。最新研究的PCR-限制性內(nèi)切酶技術(shù)和熒光PCR的出現(xiàn)，對于清除和預(yù)防副結(jié)核病，保護人們的身體健康，促進畜牧業(yè)快速健康發(fā)展，具有重要的指導(dǎo)意義。

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳圖