散發(fā)性結(jié)直腸癌患者錯(cuò)配修復(fù)基因蛋白表達(dá)水平及其臨床意義

于顯博，王海江，孫振強(qiáng)，許睿瑋，趙澤亮，張 爍

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤，且發(fā)病率呈逐漸增高趨勢(shì)，造成的危害也日益嚴(yán)重[1-3]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是十分復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的參與，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活和錯(cuò)配修復(fù)基因(mismatch repair gene，MMR)的突變以及基因啟動(dòng)子甲基化等[4-5]。目前發(fā)現(xiàn)的MMR包括7種，即hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPSM1、hPSM2、hMSH3、hMSH5，其表達(dá)產(chǎn)物是一種核酸水解酶，可糾正DNA復(fù)制過(guò)程中錯(cuò)配的堿基，使復(fù)制過(guò)程更具保真性，并與腫瘤患者某些臨床病理特征有一定的關(guān)系。本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)404例新疆散發(fā)性結(jié)直腸癌患者腫瘤切除標(biāo)本hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)水平，并探討其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年5月—2012年6月收治的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者404例為研究對(duì)象，均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，其中男233例，女171例；年齡25～81歲，平均63.2歲；排除符合Amsterdam Ⅱ診斷標(biāo)準(zhǔn)的遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)、術(shù)前接受過(guò)放化療及資料不全患者。

1.2 相關(guān)定義 (1)BMI：以BMI<18.5 kg/m2為偏瘦，18.5～23.9 kg/m2為正常，24.0～27.9 kg/m2為超重，≥28.0 kg/m2為肥胖；(2)貧血：男性Hb<120 g/L，女性Hb<115 g/L。

1.3 方法 收集上述患者腫瘤切除標(biāo)本，40 g/L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，采用PV-9000二步法檢測(cè)hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)水平，hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPSM2一抗鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司，工作濃度均為1∶150；通用型兩步法(HRP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福建邁新生物制品有限公司。采用磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)替代一抗做陰性對(duì)照，以正常結(jié)直腸黏膜上皮和/或浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn) 參考許良中等[6]制定的“免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)”，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行判斷。hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6均在細(xì)胞核表達(dá)，在光鏡下每張切片選取癌細(xì)胞較多的5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。按染色強(qiáng)度分級(jí)：細(xì)胞核無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分；按陽(yáng)性細(xì)胞百分比分級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；最后將兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥2分為陽(yáng)性表達(dá)，<2分為陰性表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為正常結(jié)直腸黏膜上皮和/或浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞核染色陽(yáng)性，陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核染色缺失。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)情況 404例標(biāo)本中，共110例hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失(見(jiàn)圖1)，MMR表達(dá)缺失率為27.23%，其中hMLH1獨(dú)立表達(dá)缺失17例，hMSH2獨(dú)立表達(dá)缺失9例，hPSM2獨(dú)立表達(dá)缺失7例，hMSH6獨(dú)立表達(dá)缺失5例；hMLH1/hPSM2聯(lián)合表達(dá)缺失29例，hMSH2/hMSH6聯(lián)合表達(dá)缺失17例，hMLH1/hMSH2聯(lián)合表達(dá)缺失7例，hMLH1/hMSH6聯(lián)合表達(dá)缺失5例，hMSH2/hPSM2聯(lián)合表達(dá)缺失4例，hMLH1/hMSH2/hMSH6聯(lián)合表達(dá)缺失3例，hMSH2/hMSH6/hPSM2聯(lián)合表達(dá)缺失4例，hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6同時(shí)表達(dá)缺失3例。

注：A1、B1、C1、D1分別為hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白正常表達(dá)，A2、B2、C2、D2分別為hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失

圖1 hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×100)

Figure1 Protein expressions of hMLH1，hMSH2，hPSM2，hMSH6

2.2 單因素分析 將294例hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)正?；颊吡袨锳組，110例表達(dá)缺失患者列為B組，兩組患者年齡、性別、民族、貧血發(fā)生率、腫瘤直徑、腫瘤類型、TNM分期比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組患者BMI、腫瘤位置、腫瘤分化程度、腫瘤家族史比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.3 多因素分析 以單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的臨床病理特征為自變量(BMI≤24 kg/m2=1,BMI≥24kg/m2=0；高、中分化腺癌=1，低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌=0；左半結(jié)腸、直腸=1，右半結(jié)腸=0；腫瘤家族史陰性=1，腫瘤家族史陽(yáng)性=0)，以hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失為因變量(是=0，否=1)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示BMI、腫瘤分化程度、腫瘤位置、腫瘤家族史對(duì)回歸方程的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失與散發(fā)性結(jié)直腸癌患者臨床病理特征關(guān)系的多因素分析結(jié)果

Table2 Correlation between protein expressions deficiency of hMLH1，hMSH2，hPSM2，hMSH6 and clinical pathological features in patients with sporadic colorectal carcinoma by multivariate analysis

變量b值SEWaldχ2值dfOR(95%CI)P值BMI0.6290.2377.05511.877(1.179,2.986)0.008腫瘤分化程度0.6640.2367.94011.943(1.224,3.085)0.005腫瘤位置0.8000.2629.34112.227(1.333,3.720)0.002腫瘤家族史0.8410.3705.16012.318(1.122,4.789)0.023

3 討論

結(jié)直腸癌分為遺傳性和散發(fā)性兩種，其中散發(fā)性結(jié)直腸癌約占全部結(jié)直腸癌的85%[7-8]，HNPCC是遺傳性結(jié)直腸癌中研究較多且發(fā)病機(jī)制較明確的，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)被認(rèn)為與MMR的種系突變密切相關(guān)[9]，且約15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌有著與HNPCC相同的發(fā)病機(jī)制[10]。MMR在生物進(jìn)化過(guò)程中扮演著重要的角色，DNA復(fù)制過(guò)程十分精細(xì)但常會(huì)出現(xiàn)堿基錯(cuò)配，當(dāng)發(fā)生堿基錯(cuò)配時(shí)MMR蛋白開(kāi)始發(fā)揮作用，它們識(shí)別并修復(fù)錯(cuò)配的堿基、維持基因組的穩(wěn)定性，但當(dāng)MMR存在缺陷不能完整表達(dá)時(shí)，就會(huì)加劇DNA突變頻率，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前，hMLH1和hMSH2突變是MMR中研究最多的，共占MMR突變的80%以上，其表達(dá)缺失與自身甲基化的發(fā)生密切相關(guān)[11-12]，且兩者的表達(dá)情況對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)的存在有很好的預(yù)測(cè)價(jià)值[13]，而多數(shù)研究表明MSI的存在預(yù)示更好的預(yù)后[14-15]。

表1 hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失與散發(fā)性結(jié)直腸癌患者臨床病理特征關(guān)系的單因素分析結(jié)果

Table1 Correlation between protein expressions deficiency of hMLH1，hMSH2，hPSM2，hMSH6 and clinical pathological features in patients with sporadic colorectal carcinoma by univariate analysis

A組(n=294)B組(n=110)χ2值P值A(chǔ)組(n=294)B組(n=110)χ2值P值年齡(歲)0.2740.601腫瘤直徑(cm)1.2580.533 <508830 <46825 ≥5020680 4～515653性別0.3350.563 ≥67032 男性16766腫瘤分化程度9.2160.010 女性12744 高、中分化腺癌20058民族3.9070.272 低分化腺癌4420 漢族21973 黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌5032 維吾爾族3816腫瘤類型0.2570.880 回族2112 潰瘍型19676 其他149 腫塊型8529BMI(kg/m2)7.9110.048 浸潤(rùn)型135 <18.5204TNM分期1.0610.786 18.5～23.913337 Ⅰ期218 24.0～27.910749 Ⅱ期10433 ≥28.03420 Ⅲ期14459貧血1.2380.266 Ⅳ期2510 有8325腫瘤家族史7.5100.023 無(wú)21185 結(jié)直腸癌家族史2016腫瘤位置11.6070.003 非結(jié)直腸癌家族史4521 直腸15946 無(wú)腫瘤家族史22973 左半結(jié)腸8628 右半結(jié)腸5136

注：其他民族包括哈薩克族、蒙古族、錫伯族、滿族；右半結(jié)腸癌包括回盲部癌、升結(jié)腸癌、結(jié)腸肝曲癌、橫結(jié)腸癌，左半結(jié)腸癌包括結(jié)腸脾曲癌、降結(jié)腸癌、乙狀結(jié)腸癌

Lindor等[16]通過(guò)對(duì)1 114例散發(fā)性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中20.4%患者存在hMLH1蛋白表達(dá)缺失，8.8%存在hMSH2蛋白表達(dá)缺失，且hMLH1蛋白表達(dá)缺失率高于hMSH2蛋白。本研究結(jié)果顯示，hMLH1蛋白表達(dá)缺失率為15.84%(64/404)，hMSH2蛋白表達(dá)缺失率為11.63%(47/404)，hMLH1蛋白表達(dá)缺失率高于hMSH2蛋白，提示hMLH1和hMSH2突變?cè)谏l(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中有一定作用；而hMLH1蛋白表達(dá)缺失率高的原因是hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島易被甲基化，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯障礙，最終造成表達(dá)缺失[11]，hMSH2表達(dá)缺失主要是由錯(cuò)義突變(missense mutations)引起[17]。Bellizzi等[18]研究指出，MMR蛋白表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌患者某些臨床病理特征有一定相關(guān)性，在結(jié)直腸癌的臨床診治中具有重要的指導(dǎo)意義。本研究進(jìn)行的單因素分析和多因素Logistic回歸分析結(jié)果均顯示，hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)正常患者與表達(dá)缺失患者間BMI、腫瘤位置、腫瘤分化程度、腫瘤家族史存在明顯差異，提示hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)與散發(fā)性結(jié)直腸癌患者BMI、腫瘤位置、腫瘤分化程度、腫瘤家族史有一定相關(guān)性。

目前，隨著人們生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的變化，多肉食少纖維的飲食習(xí)慣導(dǎo)致超重、肥胖者越來(lái)越多，而多數(shù)研究表明肥胖與結(jié)直腸癌的發(fā)病有著密切聯(lián)系[19]。本組患者中，hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失患者中超重、肥胖者所占比例更高，提示超重、肥胖的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR蛋白更容易出現(xiàn)表達(dá)缺失，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20-21]。但Duval等[22]研究認(rèn)為MMR蛋白表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)突變，而肥胖是否會(huì)影響MMR蛋白表達(dá)缺失的結(jié)直腸癌患者IGFR突變尚不可知，肥胖與MMR蛋白表達(dá)缺失之間的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究明確。本組患者中，hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失患者多為低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16，23]，提示分化程度低的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR蛋白更容易出現(xiàn)表達(dá)缺失，其原因可能與低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌的病理組織學(xué)特征多表現(xiàn)為MSI-H(MSI-high)有關(guān)。此外，本組患者中，hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失患者腫瘤多位于右半結(jié)腸，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24-25]，提示腫瘤位于右半結(jié)腸的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR蛋白更容易出現(xiàn)表達(dá)缺失，右半結(jié)腸癌與直腸癌、左半結(jié)腸癌患者存在差異，分析其原因與右半結(jié)腸癌發(fā)生階段可能存在更高比例的基因啟動(dòng)子甲基化、病理組織學(xué)特征傾向于MSI-H表達(dá)及右半結(jié)腸與左半結(jié)腸、直腸生物學(xué)和分子學(xué)特征不同有關(guān)[26]，MMR蛋白表達(dá)可能更多地參與腫瘤發(fā)生的早期階段。Aaltonen等[27]研究指出，結(jié)直腸癌患者中有遺傳病史者占15%～20%，且HNPCC占有一定比例(1%～6%)，而結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制與MMR蛋白表達(dá)缺失密切相關(guān)，但有關(guān)結(jié)直腸癌家族史陽(yáng)性患者發(fā)病機(jī)制與MMR蛋白表達(dá)缺失的關(guān)系研究報(bào)道較少。本組患者中，hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失患者腫瘤家族史陽(yáng)性所占比例更高，提示腫瘤家族史陽(yáng)性的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR蛋白更容易出現(xiàn)表達(dá)缺失，與Molaei等[24]研究報(bào)道一致，腫瘤家族史陽(yáng)性散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的發(fā)病機(jī)制與MMR蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

研究表明，MMR蛋白表達(dá)缺失的散發(fā)性結(jié)直腸癌患者有著更好的預(yù)后[28]，且無(wú)貧血者預(yù)后更好[29]。本研究結(jié)果顯示，hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白表達(dá)正?；颊吲c表達(dá)缺失患者間年齡、性別、民族、貧血發(fā)生率、腫瘤直徑、腫瘤類型、TNM分期均無(wú)明顯差異，分析其原因主要有以下兩個(gè)方面：(1)新疆地區(qū)人群構(gòu)成特殊，而本研究中少數(shù)民族患者數(shù)量較少，未能分析不同民族間MMR蛋白表達(dá)差異；(2)本研究以hMLH1、hMSH2、hPSM2、hMSH6蛋白中任意一種蛋白表達(dá)陰性即判定為MMR蛋白表達(dá)缺失，未單獨(dú)對(duì)每種蛋白表達(dá)缺失情況與患者臨床病理特征間的相關(guān)性進(jìn)行分析。因此，需在今后的研究中開(kāi)展更大樣本量及更細(xì)致的研究，進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制。

綜上所述，新疆地區(qū)散發(fā)性結(jié)直腸癌患者存在MMR蛋白表達(dá)缺失，且其表達(dá)缺失與患者BMI、腫瘤位置、腫瘤分化程度、腫瘤家族史有關(guān)，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)MMR蛋白表達(dá)對(duì)判斷散發(fā)性結(jié)直腸癌病情及預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。

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