碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因的研究

李光榮，宋 敏，楊建波，劉靳波

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種條件致病菌，其大量存在于醫(yī)療環(huán)境中，是引起醫(yī)院感染的主要病原菌。近年來，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii；MDR-Ab)和泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在臨床中大量出現(xiàn)，其臨床分離率位居我國臨床常見革蘭陰性桿菌第4位[1]，其感染率、耐藥率和臨床致死率日益嚴(yán)重，已引起醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注。碳青霉烯類抗菌藥物是一類新型的小分子、高效、廣譜的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，該藥為迄今抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的一類抗菌藥物，是治療多種細(xì)菌混合感染及免疫缺陷者感染的一線藥物。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類抗菌藥物的鮑曼不動(dòng)桿菌不斷出現(xiàn)并廣泛傳播[2]。鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶是碳青霉烯類抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制之一，其能夠水解碳青酶烯類抗菌藥物而導(dǎo)致耐藥。目前此類水解酶主要是Ambler分子結(jié)構(gòu)分類法中的B類和D類β-內(nèi)酰胺酶，B類酶又稱金屬酶，包括IMP型、VIM型等；D類酶又稱苯唑西林酶，包括OXA-23、OXA-24、OXA-58 等[3]。為了解鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性和碳青霉烯酶相關(guān)耐藥基因的存在情況，本研究對(duì)臨床分離的88株MDR-Ab進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 88株MDR-Ab來自2012年1月—2013年5月瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收集的臨床標(biāo)本，主要包括痰、分泌物、腦脊液、尿、血液、咽拭子等標(biāo)本，其中呼吸道標(biāo)本71株(80.7%)。標(biāo)本來源科室主要為重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)和神經(jīng)外科。

1.1.2 主要儀器與試劑 MicroScan WalkAway96全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)購自西門子公司；C1000TM Thermal Cycle PCR擴(kuò)增儀與GelDoc XR凝膠成像儀購自美國Bio-RAD，PCR引物由上海生物工程有限公司合成；Premix Tag酶體系及DNA Marker-A(GeneRuler 100 bp)購自上海生物工程有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 從Gen Bank中分別獲得鮑曼不動(dòng)桿菌的目的基因OXA-23、OXA-24、OXA-58、IMP、VIM的基因序列全長，特異性引物序列參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行設(shè)計(jì)(見表1)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 88株MDR-Ab使用MicroScan WalkAway96全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)鑒定并獲得，同時(shí)此系統(tǒng)檢測其對(duì)氨芐西林-舒巴坦、阿米卡星、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、加替沙星、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、他唑巴坦、哌拉西林、復(fù)方新諾明、妥布霉素的最小抑菌水平(MIC)，所有MDR-Ab經(jīng)檢測鑒定后凍存于-80 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)操作及藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2011年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸桿菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853。

表1 靶基因引物序列和產(chǎn)物長度

注：P1=特異性引物1(正向引物)， P2=特異性引物2(反向引物)

1.2.2 鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯類耐藥驗(yàn)證試驗(yàn) 儀器法篩選鑒定出亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，再采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，亞胺培南、美羅培南藥敏紙片對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行驗(yàn)證，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2011年CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 DNA模板制備 采用煮沸法[5]，挑取已分純單克隆菌落放入含1 ml 0.9%氯化鈉溶液的塑料離心管(EP管)內(nèi)，混勻后8 000 r/min離心2 min，離心半徑為10 cm，棄上清液后加100 μl蒸餾水充分震蕩混勻，95 ℃干浴10 min，再12 000r/min離心2 min，離心半徑為10 cm，上清液即為檢測模板。

1.2.4 反應(yīng)體系及條件 靶基因引物識(shí)別序列和目的產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增體系均為：10×buffer 3 μl，MgCl21.8 μl，dNTPs 0.24 μl，P1和P2引物各1.2 μl，TaqDNA酶0.6 μl，DNA模板2.4 μl，用無菌水補(bǔ)足至總體積30 μl。擴(kuò)增條件為：96 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 35 s、55 ℃ 30s、72 ℃ 60s(循環(huán)34個(gè)周期)，72 ℃延長至5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增與成像 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，采用無菌0.9%氯化鈉溶液為陰性對(duì)照，出現(xiàn)目的條帶即為檢測基因陽性，凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝像保存。

1.2.6 PCR產(chǎn)物測序 PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物任選兩個(gè)送上海生物工程有限公司進(jìn)行純化并測序，測序儀器為3730xl DNA Analyzer，測序試劑為BigDye terminator v3.1。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果 88株MDR-Ab對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物(包括頭孢菌素類如頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟等；碳青霉稀類藥物如亞胺培南)、氨基糖苷類藥物(包括慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素等)、喹諾酮類藥物(包括環(huán)丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星)、磺胺類抗菌藥(包括復(fù)方新諾明)等15種常規(guī)抗菌藥物的抗菌活性見表2。對(duì)亞胺培南耐藥率為54.5%，對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟、哌拉西林的耐藥率均達(dá)到86.4%，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率為71.6%～86.4%。

表2 88株MDR-Ab對(duì)抗菌藥物的敏感性

2.1.2 鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯類耐藥驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 MicroScan WalkAway96全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)檢測出對(duì)亞胺培南耐藥的48株鮑曼不動(dòng)桿菌，在K-B法中對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為100%(見表3)。

表3 MDR-Ab對(duì)亞胺培南和美羅培南K-B法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table3 The sensitivity test results of MDR-Ab to imipenem and meropenem by K-B method

藥物耐藥株數(shù) %中介株數(shù) %敏感株數(shù) %亞胺培南481000000美羅培南481000000

2.2 基因檢測結(jié)果

2.2.1 MDR-Ab的β-內(nèi)酰胺酶基因擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)88株MDR-Ab進(jìn)行OXA-23、OXA-24、OXA-58、IMP、VIM基因檢測，其中47株攜帶OXA-23基因，9株攜帶OXA-58基因，16株攜帶VIM基因，2株攜帶OXA-23+OXA-58+VIM基因，5株攜帶OXA-23+OXA-58基因，14株攜帶OXA-23+VIM基因；未檢測到攜帶IMP、OXA-24基因的MDR-Ab(見表4)。

表4 88株MDR-Ab的β-內(nèi)酰胺酶基因擴(kuò)增結(jié)果〔n(%)〕

2.2.2 碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因擴(kuò)增結(jié)果 48株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，34株攜帶OXA-23，9株攜帶OXA-58，15株攜帶VIM，13株攜帶OXA-23+VIM基因，5株攜帶OXA-23+OXA-58基因，2株攜帶OXA-23+OXA-58+VIM基因(見表5)。

2.2.3 PCR陽性產(chǎn)物電泳結(jié)果 對(duì)OXA-23、OXA-58、VIM基因擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳跑膠，其電泳結(jié)果見圖1～4。

2.2.4 PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物測序結(jié)果 OXA-23、OXA-58、VIM 3種基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后的陽性產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST程序?qū)Ρ确治雠cNCBI的相應(yīng)基因序列的同源性分別為99%、99%和97%～99%(見圖5～7)。

表5 碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因擴(kuò)增結(jié)果

Table5 The beta-lactamase gene amplification results of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

基因名稱陽性菌株〔n(%)〕OXA-2334(708)OXA-589(188)VIM15(313)OXA-23+OXA-58+VIM2(42)OXA-23+OXA-585(104)OXA-23+VIM13(271)IMP0 OXA-240

注：M為GeneRuler100 bp ladder；N為陰性對(duì)照；1～7為陽性標(biāo)本，1 058 bp

圖1 OXA-23基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure1 The results of electrophoresis products of OXA-23 gene PCR positive

注：M為GeneRuler100 bp ladder；N為陰性對(duì)照；1～7為陽性標(biāo)本，780 bp

圖2 VIM基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure2 The results of electrophoresis products of VIM gene PCR positive

注：M為GeneRuler100 bp ladder；N為陰性對(duì)照；P為陽性對(duì)照；16sDNA，150 bp

圖4 16sDNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure4 The results of electrophoresis products of 16sDNA gene PCR positive

注：M為GeneRuler100 bp ladder；N為陰性對(duì)照；1～7為陽性標(biāo)本，580 bp

圖3 OXA-58基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure3 The results of electrophoresis products of OXA-58 gene PCR positive

圖5 鮑曼不動(dòng)桿菌的OX-23基因部分測序峰圖

圖6 鮑曼不動(dòng)桿菌的VIM基因部分測序峰圖

圖7 鮑曼不動(dòng)桿菌的OX-58基因部分測序峰圖

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院院內(nèi)感染的主要病原菌之一，尤其是MDR-Ab的出現(xiàn)常導(dǎo)致感染者不治身亡[6]。感染控制界稱之為“21世紀(jì)革蘭陰性桿菌的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)”。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制包括滅活酶、鈍化酶導(dǎo)致抗菌藥物失活；外膜蛋白缺失和細(xì)菌生物膜的形成導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變靶位青霉素結(jié)合蛋白改變；細(xì)菌對(duì)藥物的主動(dòng)外排導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物水平降低等。

本研究結(jié)果顯示，MDR-Ab對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物(包括頭孢菌素類、碳青霉稀類藥物)、氨基糖苷類藥物、喹諾酮類藥物的耐藥率均較高，除對(duì)亞胺培南耐藥率為54.5%，對(duì)其余14種抗菌藥物的耐藥率均在71.6%以上。中國耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示，2009—2011年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南耐藥率分別為54.8%、57.1%、58.1%，而本院2009—2011年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的耐藥率分別為16.8%、21.3%、57.1%。由此可見，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥情況相當(dāng)嚴(yán)峻，并且隨著時(shí)間的推移耐藥率越來越高。分析其原因主要為：(1)細(xì)菌耐藥基因自發(fā)性突變；(2)抗菌藥物選擇造成的環(huán)境壓力，使耐藥基因不斷的遺傳和傳遞。有資料顯示,鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況與抗菌藥物的使用率、總使用強(qiáng)度、β-內(nèi)酰胺類藥物和喹諾酮類藥物的使用強(qiáng)度呈正相關(guān)[7]。本研究分離出MDR-Ab的標(biāo)本以呼吸道標(biāo)本為主(80.7%)，鮑曼不動(dòng)桿菌極可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)呼吸道感染，這與國內(nèi)外大多數(shù)報(bào)道接近[8]。MDR-Ab臨床感染科室以ICU和神經(jīng)外科為主，主要是由于這些病房的患者病情較重，輸液時(shí)間較長，插管等侵入性操作及激素、免疫抑制劑等治療手段的應(yīng)用使患者免疫力下降，在一定程度上造成了MDR-Ab的定植和擴(kuò)散。同時(shí)為抗感染而預(yù)防性地大量使用抗菌藥物，也誘導(dǎo)了耐藥菌的產(chǎn)生，給臨床治療帶來了很大困難[8-9]。

OXA-23基因是質(zhì)粒和染色體介導(dǎo)的耐藥基因，是鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的主要基因之一，其在各地的陽性率不同。本研究中88株MDR-Ab共檢測出OXA-23(53.4%)、OXA-58(10.2%)、VIM(18.2%)3種基因，經(jīng)BLAST程序?qū)Ρ确治觯cNCBI的相應(yīng)基因序列的同源性分別為99%、99%和97%～99%，其中OXA-23基因陽性率明顯高于OXA-58、VIM、IMP以及OXA-24基因。OXA-23基因陽性菌株中不僅有對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥株，也有敏感株。在48株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，OXA-23陽性34株(70.8%)，余琳等[10]和楊均均等[11]對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行OXA-23基因檢測，陽性率分別為75.8%和71.6%，本研究結(jié)果與之相近。說明OXA-23基因可能為鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌VIM基因陽性率為18.2%，OXA-58陽性率為10.2%，與湯鳳珍等[12]的報(bào)道相似。表明這些基因與碳青霉烯類抗菌藥物耐藥有重要關(guān)系，同時(shí)也反映出各地區(qū)耐藥率的差異。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)2株MDR-Ab同時(shí)攜帶OXA-23、OXA-58和VIM基因，5株MDR-Ab同時(shí)攜帶OXA-23和OXA-58基因，14株MDR-Ab同時(shí)攜帶OXA-23和VIM基因，說明多種耐藥基因的攜帶是MDR-Ab對(duì)常用抗菌藥物耐藥的重要原因。

綜上所述，細(xì)菌耐藥是多種機(jī)制綜合作用的結(jié)果，本研究顯示MDR-Ab對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥與攜帶多種基因密切相關(guān)，因此及時(shí)檢測MDR-Ab的耐藥性及耐藥基因攜帶情況，對(duì)于預(yù)防和控制MDR-Ab感染具有重要意義。

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