埃索美拉唑?qū)θ宋干掀ぜ?xì)胞抗氧化損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究

胡 楊，吳 清，劉朝霞，傅 念，陽學(xué)風(fēng)

生理情況下，胃黏膜的完整性依賴于機(jī)體的損傷因素和防御機(jī)制之間的平衡。目前,雖然對引起胃黏膜損傷的因素有了較深的認(rèn)識，但對參與胃黏膜防御的細(xì)胞和分子機(jī)制仍不明了。血紅素氧合酶1(HO-1)是催化血紅素降解為一氧化碳(CO)、亞鐵離子和膽紅素的限速酶，并在機(jī)體的抗炎癥、抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用[1]。研究顯示，HO-1在胃上皮細(xì)胞質(zhì)中成組性表達(dá)，而幽門螺桿菌感染后，HO-1表達(dá)水平顯著增高[2]，此外，維生素C對胃黏膜的保護(hù)作用可能與誘導(dǎo)HO-1表達(dá)有關(guān)，且HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)可促進(jìn)大鼠潰瘍模型的愈合[3]。因此，以HO-1為出發(fā)點(diǎn)，尋求相應(yīng)的誘導(dǎo)劑，對治療胃黏膜損傷具有重要意義。埃索美拉唑是一種新型的質(zhì)子泵抑制劑(PPI)，通過抑制胃壁細(xì)胞的H+/K+-ATP酶來降低胃酸分泌，防止胃酸的形成，臨床上用于治療由高分泌胃酸引起的胃腸道黏膜疾病，如胃潰瘍和反流性食管炎等疾病[4-5]。然而,近期也有研究顯示多種酸泵拮抗劑對胃黏膜本身具有多效作用，包括抗凋亡作用、抑制活性氧(ROS)的形成和抑制巨噬細(xì)胞黏附素分子的表達(dá)。這類藥物不僅用于治療各種胃黏膜疾病，同時對Crohn病也有一定療效。由于ROS在胃黏膜損傷中的作用日益受到重視，因此PPI對ROS的清除可能是其抗酸之外的胃黏膜保護(hù)效應(yīng)的重要機(jī)制[6-7]。本研究旨在探討埃索美拉唑?qū)ξ干掀ぜ?xì)胞表達(dá)HO-1的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 埃索美拉唑購自Astrazeneca公司，SYBGREEN PCR Mix購自ABI公司，TRIZol購自Invitrogen公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，HO-1活性試劑盒購自上海GENMED公司，RIPA裂解液、ECL試劑盒購自Pierce公司，BCA試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司，HO-1和β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自 Gibco公司，放線菌素D(ActD)和放線菌酮(CHX)購自Sigma-Adrich公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 人胃上皮AGS細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)環(huán)境中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)基顏色變黃，此時細(xì)胞基本滿瓶，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min(離心半徑12 cm)，棄去培養(yǎng)基，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液于6孔板中調(diào)整其密度為1×105/ml，37 ℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為對照組和埃索美拉唑組。其中對照組加入等量的RPMI 1640培養(yǎng)基。埃索美拉唑組加入0.1、0.5、1.0 μg/ml的埃索美拉唑(用0.9%氯化鈉溶液溶解)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆跤鄳?yīng)時間后用于如下分析。

1.3 光澤精化學(xué)發(fā)光分析法測定ROS 接種于6孔板中的細(xì)胞經(jīng)埃索美拉唑孵育8 h后，PBS洗滌，胰蛋白酶解并用PBS重懸浮。加入50 μmol/L光澤精和100 μmol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。為了觀察HO-1對ROS的影響，埃索美拉唑加入前，AGS細(xì)胞首先與2,4-二甘油次卟啉鋅(ZnDPBG)預(yù)孵育15 min。數(shù)據(jù)采用相對光單位(RLU)表示，計算公式為待測樣品RLU/NAPDH處理組RLUmax×100%。

1.4 實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測mRNA的表達(dá) 細(xì)胞處理結(jié)束后，根據(jù)試劑盒操作說明提取總RNA(FUJIFILM)并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物用RNA酶處理。設(shè)計特異性引物用于檢測HO-1、環(huán)氧化酶(COX)-1和COX-2的表達(dá)量。HO-1正向引物：5′-GCTCAAAAAGATTGCCCAGA-3′；反向引物：5′-GCGGTAGAGCTGCTTGAACT-3′。COX-1正向引物：5′-CAAGGAAGCAGCCTCAGAGT-3′，反向引物：5′-AGGCCTGGAACTGAGTCAAA-3′。COX-2正向引物：5′-GCCATCTTTGGTGAAACCAT-3′，反向引物：5′-AGTGCTTGGCTTCCAGTAGG-3′。50 μl反應(yīng)體系包括：25 μl 2×SYBR Green Master Mix〔200 nmol/L dATP、dGTP和dCTP；400 nmol/L dUTP；2 mmol/L氯化鎂(MgCl2)，0.25 U尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)，0.625 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶〕，25 pmol 正向和反向引物，2 μl cDNA。酶利用ABI Prism 5700對HO-1進(jìn)行擴(kuò)增。首先50 ℃ 2 min；95℃ 10 min；隨后95 ℃ 15 s；60 ℃變性、延伸60 s，共40個循環(huán)。同時采用β-actin為內(nèi)參。mRNA表達(dá)倍數(shù)改變采用2ΔCt表示，ΔCt=(Ct對照基因-Ctβ-actin)-(Ct待測基因-Ctβ-actin)。

1.5 Western blotting法檢測HO-1蛋白表達(dá)水平 6孔板中細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后，加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，上清液即為細(xì)胞總蛋白。裂解液中的蛋白用Bradford試劑在分光光度計中測定595 nm處吸光度。50～70 μg總蛋白在5%～10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%無脂牛奶封閉后，分別用一抗、二抗孵育。ECL發(fā)光，顯影。

1.6 比色法測定HO-1酶活性 分別收集細(xì)胞于1.5 ml的EP管中，離心棄上清液，加1.5 ml的GENMED清理液A清洗細(xì)胞，隨后加入100 μl GENMED裂解液B，超聲裂解細(xì)胞。按試劑盒要求將EP管標(biāo)志為背景管和樣品管，按順序分別加入GENMED 340 μl緩沖液C、20 μl GENMED反應(yīng)液D、20 μl GENMED底物液E，背景管加入20 μl GENMED陰性液F，樣品管加入20 μl待測樣品。37 ℃溫育60 min，加入400 μl GENMED終止液終止反應(yīng)。取100 μl綠色相到96孔酶標(biāo)板中，分別讀取464 nm和530 nm波長的吸光度。同時測定各樣品的蛋白濃度，計算HO-1酶活性。

2 結(jié)果

2.1 埃索美拉唑?qū)ADPH誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響 AGS細(xì)胞與埃索美拉唑孵育8 h后，能顯著抑制NADPH誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。其中1.0 μg/ml埃索美拉唑能使ROS產(chǎn)生量降低(73.3±3.5)%(見圖1)。

2.2 埃索美拉唑?qū)GS細(xì)胞HO-1 mRNA的影響 AGS細(xì)胞經(jīng)0.1～1.0 μg/ml埃索美拉唑孵育8 h后，實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，0.5 μg/ml埃索美拉唑處理后，HO-1 mRNA增高8.2倍；1.0 μg/ml埃索美拉唑處理后，HO-1 mRNA增高了38.4倍(見圖2)。

注：1對照組，2 NADPH組，3 NADPH+0.1 μg/ml埃索美拉唑組，4 NADPH+0.5 μg/ml埃索美拉唑組，5 NADPH+1.0 μg/ml埃索美拉唑組

圖1 埃索美拉唑?qū)ADPH誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響

Figure1 Effect of esomeprazole on NADPH-induced ROS production in gastric epithelial cells

注：1 對照組，2 0.1 μg/ml埃索美拉唑組，3 0.5 μg/ml埃索美拉唑組，4 1.0 μg/ml 埃索美拉唑組

圖2 埃索美拉唑?qū)GS細(xì)胞HO-1 mRNA的影響

Figure2 Effect of esomeprazole on HO-1 mRNA expression in gastric epithelial cells

2.3 埃索美拉唑?qū)GS細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)及酶活性的影響 不同濃度的埃索美拉唑刺激AGS細(xì)胞后，HO-1蛋白的表達(dá)量隨其濃度的遞增而增高，而內(nèi)參β-actin在所有處理組中保持恒定(見圖3A)。埃索美拉唑作用后，HO-1酶活性也隨著其濃度的增加而增加(見圖3B)。

2.4 埃索美拉唑?qū)OX mRNA的影響及抑制劑處理后對HO-1表達(dá)的影響 埃索美拉唑處理后，AGS細(xì)胞內(nèi)COX-1和COX-2 mRNA表達(dá)水平無變化(見圖4A)。而AGS細(xì)胞首先經(jīng)30 μmol/L萘普生和羅非昔布分別作用后，對HO-1表達(dá)無影響(見圖4B)。

注：A埃索美拉唑?qū)O-1蛋白表達(dá)的影響，B埃索美拉唑?qū)O-1酶活性的影響；1 對照組，2 0.1 μg/ml埃索美拉唑組，3 0.5 μg/ml埃索美拉唑組，4 1.0 μg/ml 埃索美拉唑組

圖3 埃索美拉唑?qū)GS細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)及酶活性的影響

Figure3 Effect of esomeprazole on HO-1 protein expression and enzymic activity in gastric epithelial cells

2.5 ActD與CHX對埃索美拉唑誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的影響 AGS細(xì)胞用不同濃度的抑制劑ActD(見圖5A)和翻譯水平的抑制劑CHX(見圖5B)進(jìn)行預(yù)處理后，加埃索美拉唑刺激8 h，結(jié)果顯示不同濃度的ActD和CHX抑制了HO-1的產(chǎn)生。

3 討論

潰瘍發(fā)生的根本原因是胃黏膜中損傷與修復(fù)因素失衡所致。在此過程中，ROS發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，來自中性氮?dú)浠衔锏腛2-氧化成H2O2后穿過中性粒細(xì)胞膜滲入胃黏膜中，隨后轉(zhuǎn)化為HOCl-和HO-，產(chǎn)生更多的有毒物質(zhì)。HOCl-與氨(NH3)反應(yīng)產(chǎn)生毒性更高的物質(zhì)——一氯氨(NH2Cl)。這些有毒的ROS可引起胃黏膜層損傷。持續(xù)的炎癥促進(jìn)了胃炎的進(jìn)程，腸上皮化生，發(fā)育異常，甚至發(fā)生胃癌。另外，氧化應(yīng)激能進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS以及更多的炎性因子[8]。奧美拉唑和蘭索拉唑能有效降低胃黏膜細(xì)胞中ROS的含量。在本研究也顯示埃索美拉唑也具有類似的效應(yīng)，1.0 μg/ml埃索美拉唑處理胃上皮細(xì)胞后，HO-1 mRNA達(dá)到峰值。而人體服用埃索美拉唑片40 mg 2 h后，埃索美拉唑血漿中的濃度接近0.9 μg/ml[9]，這與誘導(dǎo)HO-1表達(dá)所需要的濃度非常接近。HO-1是催化血紅素降解為CO、Fe2+和膽紅素的限速酶，并在機(jī)體的抗炎癥、抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用[2]。埃索美拉唑誘導(dǎo)產(chǎn)生的HO-1可能是其發(fā)揮胃上皮保護(hù)作用的重要因素，同時，HO-1產(chǎn)物膽紅素和CO具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡和舒血管活性，可拮抗各種損傷因素導(dǎo)致的胃黏膜損傷。此外，HO-1也具有一定的促進(jìn)潰瘍愈合的能力，并且在多種疾病(如胃炎)中表達(dá)量增高，因此可能是胃黏膜防御的重要生理因素。

注：A埃索美拉唑?qū)GS細(xì)胞COX-1和COX-2 mRNA表達(dá)的影響，B COX抑制劑對HO-1表達(dá)的影響；1對照組，2 1.0μg/ml埃索美拉唑組COX-1，3 1.0 μg/ml埃索美拉唑組COX-2

圖4 埃索美拉唑?qū)OX mRNA的影響及抑制劑處理后對HO-1表達(dá)的影響

Figure4 Effect of esomeprazole on COX mRNA and HO-1 expression by inhibitors

圖5 ActD與CHX對埃索美拉唑誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的影響

Figure5 Effect of ActD and CHX on esomeprazole-induced HO-1 protein expression

前列腺素在PPI介導(dǎo)的胃黏膜保護(hù)作用中的作用目前仍有爭議。研究顯示，患者服用高劑量PPI 14 d可引起COX-2表達(dá)增高以及前列腺素產(chǎn)生[10]。在大鼠胃黏膜組織中，蘭索拉唑?qū)OX并無誘導(dǎo)作用[11]。也有研究顯示，奧美拉唑?qū)ξ葛つぜ?xì)胞誘導(dǎo)的前列腺素E2產(chǎn)生無誘導(dǎo)作用[12]。本研究采用COX-1和COX-2抑制劑萘普生和羅菲昔布處理AGS細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)埃索美拉唑?qū)OX-1和COX-2 mRNA也無誘導(dǎo)作用。因此從這種意義上講，埃索美拉唑誘導(dǎo)的HO-1產(chǎn)生對于各種類型的損傷，尤其是非甾體抗炎藥(NSAID)胃病的防治可能具有重要意義。同時還發(fā)現(xiàn)，采用ActD和CHX處理后，埃索美拉唑誘導(dǎo)HO-1 mRNA表達(dá)降低。這表明HO-1基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄和蛋白從頭合成以及轉(zhuǎn)錄因子或其他快速代謝短效肽有關(guān)。在隨后的研究當(dāng)中將進(jìn)一步深入探討其分子機(jī)制。

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