羅格列酮對糖尿病牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響研究

黃 輝

牙周炎是一種由于細菌侵犯牙齦和牙周組織而引起的慢性炎癥，其主要特征為牙周袋的形成及袋壁的炎癥，牙槽骨吸收和牙齒逐漸松動[1]。牙周炎在糖尿病人群中發(fā)病率較高[2]，已被認為是糖尿病的第六大并發(fā)癥[3]。羅格列酮通過與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)結(jié)合而發(fā)揮作用，除了具有治療2型糖尿病[4]的功能之外，還可減輕急性、慢性炎癥反應(yīng)[5]。因此，本研究將對羅格列酮在糖尿病牙周炎大鼠牙周組織中的炎癥抑制效應(yīng)進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 馬來酸羅格列酮片(文迪雅)由葛蘭素史克(天津)有限公司提供，批號 06070021。試劑鏈脲佐菌素(批號040103)、GW9662(PPAR-γ特異拮抗劑)購自Sigma公司；細胞間黏附分子1(ICAM-1)及血管細胞黏附分子1(VCAM-1) 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自美國R&D公司。兔抗人actin多克隆抗體、兔抗人PPAR-γ多克隆抗體、兔抗人核因子κB(NF-κB)多克隆抗體、羊抗兔二抗及ECL顯影劑均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 動物分組及模型制備 選用純種雄性6月齡SD大鼠40只(廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量(236±13)g。以隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠按55 mg/kg體質(zhì)量腹腔一次性注射鏈脲佐菌素溶液，確定空腹血糖>16.7 mmol/L糖尿病動物模型建立。1周后1%戊巴比妥鈉麻醉下用直徑0.2 mm的正畸鋼絲結(jié)扎右側(cè)上頜第一磨牙頸部，并喂黏性食料。結(jié)扎術(shù)后4周，臨床觀察見右上頜第一、二磨牙間牙齦紅腫糜爛；動物組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)合上皮與牙體分離，膠原纖維排列紊亂，牙槽嵴頂破壞吸收，確認牙周炎動物模型建立。糖尿病牙周炎動物模型建立后第1天起，對照組予10%二甲基亞砜(DMSO)2 ml/kg；糖尿病牙周炎組予DMSO 2 ml/kg；羅格列酮組予羅格列酮3 mg/kg,羅格列酮+GW9662組予羅格列酮3 mg/kg+GW9662 0.3 mg/kg,灌胃1次/d，連續(xù)1周。1周后處死大鼠，取牙齦組織，稱質(zhì)量，分別用于相關(guān)生化指標(biāo)的檢測及免疫組織切片的制備，剩余部分置液氮中保存。

1.3 牙槽骨骨吸收度測量 實驗終點處死大鼠后，截取包括實驗區(qū)磨牙的雙側(cè)上頜骨，置于10%中性甲醛溶液中，固定后脫鈣，制作石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，德國DMR+Q550病理圖像分析儀測量釉牙骨質(zhì)界(CEJ)至第一磨牙近中牙槽嵴頂(A)的垂直距離(CEJ-A)，取5張切片的平均值。

1.4 牙齦組織多形核中性粒細胞計數(shù)(PMNs) 實驗終點處死大鼠后，迅速切下牙齦組織，冰0.9%氯化鈉溶液洗凈后，置于10%中性甲醛溶液中固定12 h，常規(guī)石蠟包埋。3 μm厚切片，HE染色。觀察高倍鏡下(×400)牙齦結(jié)締組織及上皮組織共20個視野，視野范圍內(nèi)計數(shù)浸潤的PMNs，取平均值。

1.5 牙齦組織ICAM-1及VCAM-1含量測定 取每只大鼠牙周組織，用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，吸干水分，稱質(zhì)量，按每0.1 g牙周組織加磷酸鹽緩沖液(PBS)1.5 ml稀釋，勻漿后，離心取上清液，置-80 ℃冰箱凍存?zhèn)錂z。ELISA法檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。用考馬斯亮藍法測定牙齦組織上清液蛋白含量。計算出每克蛋白ICAM-1及VCAM-1含量。

1.6 Western blotting測定NF-κB及PPAR-γ 取牙齦組織，液氮凍存。提取總蛋白并按Pierce BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，取細胞溶解液蛋白50 μg在80 g/L的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，冰上恒壓100 V電轉(zhuǎn)1 h，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入1∶200稀釋的兔抗人NF-κB抗體以及兔抗人PPAR-γ抗體，4 ℃過夜。TBST緩沖液漂洗后加入1∶400生物素化的羊抗兔二抗，室溫下?lián)u床雜交1 h。TBST漂洗后以ECL化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)放射自顯影。以相同方法測定內(nèi)參照β-actin的表達。通過bio-rad gel doc2000圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果,NF-κB、PPAR-γ的表達水平以NF-κB、PPAR-γ灰度值與β-actin灰度值的相對值(相對灰度值)表示。

2 結(jié)果

2.1 各組CEJ-A比較 與對照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組CEJ-A增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組CEJ-A增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 各組牙齦組織PMNs比較 與對照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組PMNs增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組PMNs增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 各組牙齦組織ICAM-1及VCAM-1含量比較 與對照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組ICAM-1及VCAM-1含量增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組ICAM-1及VCAM-1含量增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.4 各組牙齦組織NF-κB及PPAR-γ比較 與對照組比較，糖尿病牙周炎組、羅格列酮組及羅格列酮+GW9662組NF-κB表達增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與羅格列酮組比較，糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組NF-κB表達增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。羅格列酮組PPAR-γ表達高于對照組、糖尿病牙周炎組及羅格列酮+GW9662組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

Table1 Comparison of expressions of CEJ-A,PMNs,ICAM-1 and VCAM-1 in each group

組別只數(shù)CEJ-A(mm)PMNs(個)ICAM-1(ng/g)VCAM-1(ng/g)對照組100.37±0.02 2.50±1.43 247±27 536±27 糖尿病牙周炎組101.40±0.10*△24.80±2.35*△382±24*△908±49*△羅格列酮組101.05±0.10* 16.10±1.85* 317±35* 751±50* 羅格列酮+GW9662組101.35±0.11*△23.10±2.33*△364±20*△870±64*△F值276.786250.56448.923115.373P值<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

注：CEJ-A =釉牙骨質(zhì)界至第一磨牙近中牙槽嵴頂?shù)拇怪本嚯x，PMNs=多形核中性粒細胞計數(shù)，ICAM-1=細胞間黏附分子1，VCAM-1=血管細胞黏附分子1；與對照組比較，*P<0.05；與羅格列酮組比較，△P<0.05

注：NF-κB=核因子κB，PPAR-γ=過氧化物酶體增殖物激活受體γ；A各組NF-κB的Western blotting結(jié)果，B各組PPAR-γ的Western blotting結(jié)果，C各組NF-κB相對灰度值比較，D各組PPAR-γ相對灰度值比較；1為對照組,2為糖尿病牙周炎組，3為羅格列酮組，4為羅格列酮+GW9662組；與對照組比較，*P<0.05；與羅格列酮組比較，△P<0.05

圖1 各組牙齦組織NF-κB及PPAR-γ比較

Figure1 Comparison of expressions of NF-κB and PPAR-γ in gingival tissues in each group

3 討論

糖尿病是牙周炎的危險因素，同時牙周炎對糖尿病的代謝控制亦有不良影響[6]。糖尿病患者體內(nèi)長期高血糖生成的氧自由基，不但可直接損傷牙周組織，還可激活NF-κB、蛋白激酶C(PKC)等通路，產(chǎn)生白介素6(IL-6)和ICAM-1等炎性細胞因子，進而激活破骨細胞和膠原酶，導(dǎo)致骨與牙周組織破壞[7]，而抑制炎癥反應(yīng)可抑制牙槽骨吸收的速度[8]。在本研究中，也證實了這一現(xiàn)象，患有糖尿病牙周炎的大鼠CEJ-A要比正常大鼠高；同時，糖尿病牙周炎組牙齦組織中PMNs、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB均較對照組增高，這提示糖尿病牙周炎組牙齦組織炎癥反應(yīng)明顯，牙槽骨高度喪失。其機制可能在于糖尿病牙周炎組NF-κB活性增強，致其下游的炎性細胞因子ICAM-1及VCAM-1合成增加[9]。由于ICAM-1和VCAM-1的介導(dǎo)，PMNs向炎癥部位的運動也隨之增強[10]，對牙齦組織造成進一步破壞[11]，最終引起牙槽骨的吸收[12]。

羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物，是有效的核轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的選擇性激動劑，與PPAR-γ結(jié)合后，激活PPAR-γ的生物學(xué)作用，從而調(diào)控許多炎癥反應(yīng)，人工合成的PPAR-γ受體激動劑可抑制單核細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)和其他前炎性細胞因子[13]。本研究結(jié)果也證實了這一觀點。與糖尿病牙周炎組比較，羅格列酮組可減少ICAM-1、VCAM-1、NF-κB，減少PMNs浸潤，表明羅格列酮可緩解糖尿病牙周炎大鼠牙齦組織炎癥反應(yīng)，抑制CEJ-A增高。

本研究觀察到，羅格列酮組PPAR-γ表達上調(diào)。PPAR-γ配體可能在轉(zhuǎn)錄水平抑制激活蛋白-1(AP-1)和NF-κB活性[14]，因此羅格列酮可能通過上調(diào)PPAR-γ表達，抑制NF-κB活性，從而下調(diào)趨化因子ICAM-1和VCAM-1表達，減少PMNs浸潤牙齦組織，進而抑制牙周組織炎癥對牙齦組織的破壞，減少牙槽骨的吸收。此外，對于羅格列酮+GW9662組，由于使用PPAR-γ特異拮抗劑GW9662可拮抗羅格列酮上調(diào)PPAR-γ蛋白的效應(yīng)，因而抑制了羅格列酮在大鼠糖尿病牙周炎的抗炎作用。

綜上所述，在大鼠糖尿病牙周炎模型中，羅格列酮可通過上調(diào)PPAR-γ表達，抑制NF-κB活性，減少PMNs浸潤，進而減輕炎癥反應(yīng)，減少牙槽骨的吸收。但由于動物和人體之間的構(gòu)造不同，因而還有待于在臨床上進一步探索。

1 Tominari T,Hirata M,Matsumoto C,et al.Polymethoxy flavonoids,nobiletin and tangeretin,prevent lipopolysaccharide-induced inflammatory bone loss in an experimental model for periodontitis[J].J Pharmacol Sci,2012,119(4):390-394.

2 Bascones-Martínez A,Arias-Herrera S,Criado-Cámara E,et al.Periodontal disease and diabetes[J].Adv Exp Med Biol,2012,771:76-87.

3 Shetty S,Kohad R,Yeltiwar R,et al.Gingival blood glucose estimation with reagent test strips:a method to detect diabetes in a periodontal population[J].J Periodontol,2011,82(11):1548-1555.

4 Norwood P,Liutkus JF,Haber H,et al.Safety of exenatide once weekly in patients with type 2 diabetes mellitus treated with a thiazolidinedione alone or in combination with metformin for 2 years[J].Clin Ther,2012,34(10):2082-2090.

5 Ji Y,Liu J,Wang Z,et al.PPARγ agonist rosiglitazone ameliorates LPS-induced inflammation in vascular smooth muscle cells via the TLR4/TRIF/IRF3/IP-10 signaling pathway[J].Cytokine,2011,55(3):409-419.

6 Taylor GW,Bornakke WS.Periodiontal disease:associations with diabetes,glycemic control and complications[J].Oral Dis,2008,14(3):191-203.

7 鄧雨泉,付云,齊劉英,等.糖基化終產(chǎn)物對人牙齦成纖維細胞增殖和基質(zhì)金屬蛋白酶-1合成的影響[J].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志：電子版,2009,3(3):250-254.

8 Liu R,Bal HS,Desta T,et al.Diabetes enhances periodontal bone loss through enhanced resorption and diminished bone formation[J].J Dent Res,2006,85(6):510-514.

9 王永霞，李道明，李海梅,等.NF-κB p65與ICAM-1在食管鱗癌中的表達及臨床病理意義[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(22):4078-4080.

10 Yasukawa K,Tokuda H,Tun X,et al.The detrimental effect of nitric oxide on tissue is associated with inflammatory events in the vascular endothelium and neutrophils in mice with dextran sodium sulfate-induced colitis[J].Free Radic Res,2012,46(12):1427-1436.

11 Carneiro VM,Bezerra AC,Guimar?es Mdo C,et al.Decreased phagocytic function in neutrophils and monocytes from peripheral blood in periodontal disease[J].J Appl Oral Sci,2012,20(5):503-509.

12 Papadopoulos G,Weinberg EO,Massari P,et al.Macrophage-specific TLR2 signaling mediates pathogen-induced TNF-dependent inflammatory oral bone loss[J].J Immunol,2013,190(3):1148-1157.

13 Kilgore KS，Billin AN.PPARbeta/delta ligands as modulators of the inflammatory response[J].Curr Opin Investig Drugs，2008，9(5)：463-469.

14 Neri T,Armani C,Peqoli A,et al.Role of NF-kappaB and PPAR-gamma in lung inflammation induced by monocyte-derived microparticles[J].Eur Respir J,2011,37(6):1494-1502.